高效陰離子離子色譜-脈沖安培法測(cè)定食品中透明質(zhì)酸鈉含量

朱鴻達(dá)，張松艷，陳自猷

(泉州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 泉州 362000)

0 引言

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)，又名玻璃酸、玻尿酸，是一種以d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖胺為雙糖單位交替連接而成的直鏈線性陰離子粘多糖。HA 最早是由美國科學(xué)家從牛眼玻璃體中分離得到，因其具有良好的潤滑性、保濕性和黏彈性，并具有極佳的生物相容性[1-4]。我國于2008 年批準(zhǔn)透明質(zhì)酸鈉為新資源食品，使用范圍為保健食品原料。2021 年1 月7 日，國家衛(wèi)健委正式批準(zhǔn)透明質(zhì)酸鈉(即透明質(zhì)酸、玻尿酸)為新食品原料，可在普通食品中添加使用，目前為止我國還沒有針對(duì)食品中透明質(zhì)酸鈉檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。由于透明質(zhì)酸本身溶解性較差，在使用時(shí)常將其轉(zhuǎn)化為鈉鹽，即透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronate, SH)。SH 是一種白色粉末狀固體，有時(shí)也呈纖維狀，具有較好的保濕性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有機(jī)溶劑，無臭味，是一種鏈狀的天然高分子多糖類物質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[7-10]，因此建立其準(zhǔn)確定量分析方法具有重要意義。

目前，測(cè)定透明質(zhì)酸鈉含量的方法有：硫酸-咔唑法、CTAB 濁度法、凝膠色譜法、elson-morgan 法、免疫法、共振瑞利散射法等[11-16]。硫酸-咔唑法是用強(qiáng)酸將透明質(zhì)酸鈉降解成葡糖醛酸，葡糖醛酸與咔唑反應(yīng)形成有機(jī)絡(luò)合物并顯示特有的紫色，其吸光度和糖醛酸的濃度成正比，通過葡萄糖醛酸的含量來確定透明質(zhì)酸鈉的含量。CTAB 濁度法測(cè)定發(fā)酵液中透明質(zhì)酸鈉的含量是利用HA 可同(CTAB)等陽離子表面活性劑發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生混濁現(xiàn)象，并在一定濃度范圍內(nèi)遵循朗伯-比爾定律，但該方法的缺點(diǎn)是不適合實(shí)時(shí)檢測(cè)。利用凝膠色譜法測(cè)定透明質(zhì)酸鈉含量，該方法操作復(fù)雜，分析速度慢，價(jià)格昂貴，對(duì)人員操作水平要求高。此外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前常用的SH 含量測(cè)定方法主要是通過降解后顯色，結(jié)合可見-紫外分光光度計(jì)，根據(jù)吸光度測(cè)定其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄糖的含量，進(jìn)而推算SH 的含量。這種方法操作比較復(fù)雜，條件苛刻，顯色劑的引入干擾測(cè)定的準(zhǔn)確度[17-19]。本文用硼砂作催化劑對(duì)透明質(zhì)酸鈉用硫酸進(jìn)行酸解，將葡萄糖醛酸分離出來。利用高效陰離子離子色譜-脈沖安培法測(cè)定葡萄糖醛酸的含量，通過折算系數(shù)，確定透明質(zhì)酸鈉的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS5000+ 離子色譜儀(美國DIONEX)：配脈沖安培檢測(cè)器；XS205DU 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Vortex-6 旋渦混合器(蘇州江東精密儀器有限公司)；MONET-HH-4 電熱恒溫水浴鍋(上海沐奈實(shí)業(yè)有限公司)；FS1000Y-3 高速粉碎機(jī)(昆明雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司)；氫氧化鈉(上海國藥集團(tuán))；醋酸鈉(滬試)；硼酸(滬試)；硫酸(滬試)；葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(LMAI Bio)：純度≥98%。

1.2 試驗(yàn)方法

色譜條件：糖分析柱：Dionex CarboPac PA20 Analytical (3 mm×150 mm，6.5 μm)， 保 護(hù) 柱：CarboPac PA20 Guard (3 mm×30 mm，6.5 μm)；淋洗 液：A：NaOH (0.15 mol/L)-NaOAc(0.10 mol/L)+2%乙腈等度洗脫，體積流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：25 μL；檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器，金電極。

1.3 溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取20 mg 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL 容量瓶種，加水溶解并定容至刻度，搖勻備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋定容，配制濃度分別為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L/、20 mg/L 和50 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，該溶液臨用前現(xiàn)配。

0.025 mol/L 硼砂硫酸液：稱取4.77 g 硼砂溶于500 mL 濃硫酸(優(yōu)級(jí)純)中，保存于密封的玻璃瓶。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品1.0 g(精確至0.001 g)至25 mL 離心管中，加入超純水充分溶解并定容至刻度。準(zhǔn)確移取上述溶液1 mL 至5 mL 離心管中，置冰浴中冷卻在不斷振搖下緩緩滴加入3 mL，0.025 mol/L硼砂硫酸液，用渦旋混合器充分混勻。將其置于沸水加熱10 min(每隔5min 振搖一次)，冷卻至室溫。將上述酸解液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用純水定容。經(jīng)濾紙過濾，濾液備用，同時(shí)做空白樣。

2 檢測(cè)分析

2.1 色譜分離

對(duì)巧克力、牛奶等樣品進(jìn)行酸解后，借鑒中性單糖的離子色譜分析方法，考慮到羧基對(duì)酸性單糖在陰離子分析柱上的洗脫，采用NaOH-NaOAc 體系淋洗液進(jìn)行等度洗脫，在流動(dòng)相中添加適量有機(jī)溶解(2%乙腈)，可以抑制菌類的生長，還可以減少有機(jī)雜質(zhì)在色譜柱上的保留，從而延長色譜柱的使用壽命[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：此方法快速有效，在10 min 內(nèi)可較好實(shí)現(xiàn)葡萄糖醛酸和中性單糖及其他酸性糖的分離。

2.2 結(jié)果計(jì)算與表述

由線性方程計(jì)算葡萄糖醛酸的含量，透明質(zhì)酸鈉含量按式(1)計(jì)算：

式中：X為樣品中透明質(zhì)酸鈉的含量(mg/kg)；C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查得的對(duì)應(yīng)葡萄糖醛酸的質(zhì)量濃度(mg/L) ；2.067 5 為透明質(zhì)酸鈉重復(fù)雙糖單元質(zhì)量(401.3)與葡萄糖醛酸相對(duì)分子質(zhì)量的比值(194.1)；V為試樣溶液定容體積(mL)；m為試樣溶液所代表的質(zhì)量(g)。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

按照試驗(yàn)方法，對(duì)巧克力、飲料樣品進(jìn)行低、中、高3 個(gè)濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平測(cè)定5 次，計(jì)算回收率和RSD。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法回收率在86.0%～120.0%，RSD 在1.5%～4.0% 之間，證明該方法精密度和準(zhǔn)確度較高。

表1 精密度和加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=5)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

對(duì)一空白樣品連續(xù)平行測(cè)定11 次，檢出限按公式LOD=3×σ/S(其中σ為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為校正曲線斜率)計(jì)算，并以3 倍檢出限，作為定量限[7-9]。結(jié)果為：當(dāng)線性范圍為1～50 mg/L，線性回歸方程：Y=0.022 1X-0.000 7，R2=0.999 6。檢出限為3.2 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

3 色譜條件優(yōu)化

3.1 淋洗液的選擇

對(duì)巧克力、飲料等樣品進(jìn)行酸解后，色譜柱采用CarboPac PA20 Guard(3 mm×30 mm，6.5 μm)。采用3 種不同體系淋洗液進(jìn)行等度洗脫(淋洗液1：含0.15 mol/L 的NaOH 和0.10 mol/L 的NaOAc 的 水溶液；淋洗液2：含0.15 mol/L 的NaOH 的水溶液；淋洗液3：含0.4 mol/L NaH2PO4的水溶液)，在流動(dòng)相中添加適量有機(jī)溶解(2% 乙腈)。在其他色譜條件完全相同情況下，3 種不同體系淋洗液實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用淋洗液1 洗脫具有比其他淋洗液更好的分離效果，分離度如表2 所示。

表2 各樣品的葡萄糖醛酸峰與相鄰色譜峰的分離度

3.2 色譜柱選擇

色譜柱分別采用色譜柱1：CarboPac PA1 Analytical Column (4 mm×250 mm))和 色 譜 柱2：Dionex CarboPac PA10，色譜柱3：Dionex CarboPac PA20 Analytical (3 mm×150 mm，6.5 μm)。其余實(shí)驗(yàn)條件相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：色譜柱1、色譜柱2 和色譜柱3 均具有較好的分離度，但色譜柱3 分離效果最佳。各色譜柱的分離度如表3 所示。

表3 3 種色譜柱的葡萄糖醛酸峰與相鄰色譜峰的分離度

4 結(jié)果與討論

(1)本文建立一種基于高效陰離子色譜-脈沖安培法對(duì)食品中透明質(zhì)酸鈉含量的快速測(cè)定新方法，此方法快速有效，可在10 min 內(nèi)完成檢測(cè)。采用糖分析柱：Dionex CarboPac PA20 Analytical (3 mm×150 mm，6.5 μm)，淋 洗 液：A：NaOH(0.15 mol/L)-NaOAc(0.10 mol/L)+2% 乙腈等度洗脫，在質(zhì)量濃度為1～50 mg/L 內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R2=0.999 6，檢出限為3.2 μg/kg，定量限為10 μg/kg。采用此方法對(duì)巧克力、飲料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率均在86.0%～120%，RSD 在1.5%～3.9%之間，證明該方法精密度和準(zhǔn)確度較高，能滿足食品中透明質(zhì)酸檢測(cè)分析要求。

(2)在流動(dòng)相中添加適量有機(jī)溶解(如2%乙腈)，不僅可以抑制菌類的生長，減少有機(jī)雜質(zhì)在色譜柱上的保留，從而延長色譜柱的使用壽命。對(duì)某些分析，流動(dòng)相中加入適量的有機(jī)溶劑還可以達(dá)到一定的效果。某些離子在添加有機(jī)溶劑后保留時(shí)間有很大的變化，這樣可以將原本無機(jī)鹽體系無法分析的離子加以分離。