‘鳳丹’PoERF4基因的克隆及表達(dá)分析

魏禎禎,宋程威,郭麗麗,郭 琪,侯小改

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023)

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子作為乙烯信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子家族,由高度保守的AP2/ERF DNA結(jié)構(gòu)域組成,其中含有60～70個(gè)氨基酸[1-2]。近年來(lái)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子陸續(xù)在不同植物中被鑒定出來(lái),例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中含有147個(gè),其中122個(gè)基因?qū)儆贓RF家族,只含有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域;水稻(Oryzasativasubsp.japonica)中含有139個(gè)基因[3];葡萄(Vitisvinifera)中含有149個(gè)基因,這些基因中至少含有1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域[4];白菜(Brassicarapavar. glabra)中鑒定出291個(gè),白菜AP2/ERF基因家族同樣分為AP2、ERF、RAV和其他4個(gè)亞族[5];甜橙(Citrussinensis)中有108個(gè)基因[6]。大量研究表明,ERF亞族基因在葉衰老、阻遏鐵的獲取、負(fù)調(diào)節(jié)植物抗鹽性等方面也發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥中AtERF4和AtERF8可以通過(guò)靶向表硫代物蛋白/表硫代物調(diào)節(jié)衰老基因和許多與衰老相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)加速早熟葉片的衰老[7]。在小金海棠(Malusxiaojinensis)中MxERF4與MxFIT轉(zhuǎn)錄因子的蛋白相互作用,MxERF4直接與其啟動(dòng)子結(jié)合抑制了鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MxIRT1的表達(dá),利用病毒沉默抑制MxERF4基因的表達(dá)可致使MxIRT1表達(dá)量增加[8]。在蘋(píng)果(Malusdomestica)中MdERF4過(guò)表達(dá)對(duì)蘋(píng)果的耐鹽性有負(fù)調(diào)節(jié)作用,并且能夠直接抑制MdERF3的表達(dá)[9]。也有研究發(fā)現(xiàn),ERF轉(zhuǎn)錄因子與植株衰老、花瓣脫落和花期調(diào)控密切相關(guān)[10]。研究表明,擬南芥AtERF4基因前體因mRNA的多聚腺苷酸化作用而存在于兩種不同的亞型,ERF4-R含有EAR基序,起阻遏作用;而另一種形式ERF4-A缺乏這一基序,起激活作用,這兩種亞型通過(guò)調(diào)控CAT3基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控植株的衰老進(jìn)程[11]。在擬南芥中,AtERF1通過(guò)直接抑制FT基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)延緩開(kāi)花[12]。在玫瑰(Rosahybrida)中RhERF4可以調(diào)節(jié)編碼果膠代謝酶相關(guān)基因的表達(dá),從而通過(guò)改變果膠的代謝來(lái)調(diào)節(jié)花瓣脫落。此外,RhERF4基因的表達(dá)受生長(zhǎng)素影響,該基因表達(dá)量減少加速了花瓣的脫落,沉默RhERF4基因降低了植物離層中的果膠豐度,通過(guò)與RhBGLA1的啟動(dòng)子結(jié)合,降低RhBGLA1基因的表達(dá)來(lái)達(dá)到延緩花瓣脫落的目的[13]。

牡丹(Paeonia×suffruticosa)是我國(guó)傳統(tǒng)木本名花,其栽培歷史悠久,花朵色澤艷麗且典雅華貴,深受各國(guó)人民喜愛(ài),為我國(guó)的候選國(guó)花,具有很高的觀賞價(jià)值[14-15]。但由于牡丹自然花期短且集中,其早花和晚花品種相對(duì)較少,在產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過(guò)程中,因無(wú)法滿(mǎn)足人們對(duì)長(zhǎng)觀賞期的需求,嚴(yán)重影響牡丹的觀賞產(chǎn)業(yè)價(jià)值并限制當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展。因此,研究其花期調(diào)控和花瓣衰老的分子生物學(xué)基礎(chǔ),對(duì)實(shí)現(xiàn)牡丹周年開(kāi)花和晚花品種選育具有重要意義。

目前,前人對(duì)延長(zhǎng)植物觀賞周期的分子機(jī)制開(kāi)展了一些研究,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)PsSVP基因超表達(dá)植株與野生型植株相比,轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉大而少,植株較高且延遲開(kāi)花[16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)PsSOC1基因在煙草中異源表達(dá)可使植株提前開(kāi)花且促進(jìn)植株生長(zhǎng),Zhang等[18]將PsSOC1基因轉(zhuǎn)入擬南芥后得到同樣的結(jié)論。但關(guān)于牡丹ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的基因分離及花期調(diào)控相關(guān)研究還較少。本研究從牡丹品種‘鳳丹’(P.ostii‘Feng Dan’)3代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中,鑒定到一個(gè)與花期調(diào)控相關(guān)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子,命名為PoERF4,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探究PoERF4基因的時(shí)空表達(dá)模式和生長(zhǎng)素對(duì)該基因的調(diào)控作用,以期為牡丹花瓣衰老分子機(jī)理及改良牡丹的生物性狀的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料‘鳳丹’屬于早花牡丹品種;‘鳳丹’早花突變株系是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的‘鳳丹’的芽變品種,該品種開(kāi)花時(shí)間2020年比‘鳳丹’早7 d,2021年比‘鳳丹’早9 d;‘連鶴’(P.×suffruticosa‘Lianhe’)屬于晚花牡丹品種,該品種開(kāi)花時(shí)間2020年比‘鳳丹’晚16 d,2021年比‘鳳丹’晚10 d。上述3個(gè)品種均為白色系單瓣花型。

‘鳳丹’取自河南科技大學(xué)試驗(yàn)基地,收集其露色期、初開(kāi)期、半開(kāi)期、盛開(kāi)期、始衰期和衰敗期的花瓣、葉片、莖、花萼,以及早花‘鳳丹’突變株系和‘蓮鶴’半開(kāi)期的花瓣。當(dāng)‘鳳丹’達(dá)到圓桃期時(shí),選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的植株用100 μmol/L生長(zhǎng)素誘導(dǎo)處理,在處理后第1、2、4、8天分別取其花瓣,液氮速凍后,在超低溫-80 ℃冰箱保存樣品,用于分析生長(zhǎng)素誘導(dǎo)下的基因表達(dá)模式。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

參照天根生化科技公司植物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū),提取‘鳳丹’不同花期(露色期、初開(kāi)期、半開(kāi)期、盛開(kāi)期、始衰期、衰敗期)花瓣及不同組織(葉片、莖、花萼),以及‘鳳丹’早花突變體和‘蓮鶴’半開(kāi)期的花瓣及生長(zhǎng)素處理后的‘鳳丹’花瓣的總RNA,利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性,超微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop one,美國(guó))檢測(cè)總RNA的濃度。采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。

1.3 PoERF4基因的克隆

根據(jù)前期獲得的‘鳳丹’3代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的序列,通過(guò)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PoERF4基因的引物(表1),以‘鳳丹’花瓣cDNA為模板,用TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase(全式金)進(jìn)行擴(kuò)增,50 μL反應(yīng)體系:cDNA 2 μL,TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL,5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL,10 μmol/L正反向引物各1～2 μL,其余加ddH2O補(bǔ)齊體系。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55～58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。目的片段采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收,回收產(chǎn)物與pMD18-T Vector載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆,挑選陽(yáng)性單克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 PoERF4基因克隆和qRT-PCR分析引物

1.4 ‘鳳丹’PoERF4基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)Translate分析‘鳳丹’PoERF4基因推導(dǎo)的氨基酸序列,利用ProtParam、NCBI中數(shù)據(jù)庫(kù)CDD、Protscale、NetPhos和TMHHMM分別預(yù)測(cè)分析蛋白特性理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)親疏水性、蛋白磷酸化位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)。采用SPOMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 ‘鳳丹’PoERF4基因qRT-PCR分析

根據(jù)PoERF4基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物(表1),以‘鳳丹’actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,按照TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒的實(shí)驗(yàn)體系和程序按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),利用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量[19]。采用Excel整理數(shù)據(jù),SPSS 19.0軟件處理和分析數(shù)據(jù),Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘鳳丹’PoERF4基因的克隆及推導(dǎo)的氨基酸序列

提取‘鳳丹’花瓣總RNA,以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在1 000 bp左右有1條清晰的特異性條帶(圖1),擴(kuò)增到的片段長(zhǎng)度為1 036 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)為747 bp,編碼248個(gè)氨基酸,其ORF核苷酸序列與氨基酸見(jiàn)圖2。

M.DL2000 DNA marker; 1、2. PoERF4基因amplified product of PoERF4。

圖2 ‘鳳丹’PoERF4基因推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Deduced amino acid sequences of ‘Feng Dan’ PoERF4 gene

2.2 ‘鳳丹’PoERF4基因編碼蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域分析

PoERF4基因編碼的蛋白分子式為C2 217H3 689N747O933S174,分子質(zhì)量為61.315 56 kU,理論等電點(diǎn)(pI)為5.12,脂肪系數(shù)為23.96,不穩(wěn)定系數(shù)為34.92,數(shù)值小于40,因此預(yù)測(cè)其屬于穩(wěn)定蛋白。運(yùn)用NCBI中CDD保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,該序列存在AP2超家族結(jié)構(gòu)域和特殊DNA結(jié)合位點(diǎn),可推斷PoERF4蛋白屬于AP2家族(圖3A)。

圖3 PoERF4基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Prediction of conserved domain, affinity and hydrophobicity, transmembrane structure and phosphorylation site analysis of PoERF4 gene coding protein

2.3 ‘鳳丹’PoERF4蛋白親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)分析

利用Protscale在線分析工具預(yù)測(cè)PoERF4基因編碼蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,大多數(shù)氨基酸殘基落在親水區(qū),預(yù)測(cè)PoERF4蛋白表現(xiàn)為親水性蛋白(圖3B)。‘鳳丹’PoERF4編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)在線分析顯示,所有蛋白均在膜外,不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖3C)。用NetPhos軟件預(yù)測(cè)分析表明,PoERF4蛋白有Ser位點(diǎn)可能有17個(gè)被磷酸化,Thr位點(diǎn)可能有8個(gè)被磷酸化,Tyr位點(diǎn)可能有2個(gè)被磷酸化(圖3D)。

2.4 ‘鳳丹’PoERF4蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

使用在線分析工具SOPMA對(duì)‘鳳丹’PoERF4蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,數(shù)據(jù)表明,該蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋中包含28個(gè)氨基酸,延伸鏈中包含48個(gè)氨基酸,β-轉(zhuǎn)角中包含6個(gè)氨基酸,無(wú)規(guī)則卷曲中包含166個(gè)氨基酸,其中無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)件,且所占比例半數(shù)以上(圖4)。

圖4 PoERF4蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 PoERF4 secondary and tertiary structure prediction

2.5 ‘鳳丹’PoERF4蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將PoERF4基因的氨基酸序列上傳至NCBI在線BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選同源性較高的序列,利用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和遺傳距離分析,結(jié)果表明‘鳳丹’PoERF4與葡萄(Vitisvinifera)、夏葡萄(Vitisasetivalis)ERF4親緣關(guān)系較近,而與喜樹(shù)(Camptothecaacuminata)、茶(Camelliasinensis)等其他植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 ‘鳳丹’PoERF4蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 The phylogenetic tree analysis of PoERF4 construction in ‘Feng Dan’

2.6 ‘鳳丹’PoERF4基因的表達(dá)模式分析

以牡丹actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,采用熒光定量PCR技術(shù)分析PoERF4基因在‘鳳丹’牡丹花發(fā)育不同花期花瓣中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,PoERF4基因‘鳳丹’初開(kāi)期和始衰期花瓣的表達(dá)量很低且無(wú)顯著差異,在露色期、半開(kāi)期、盛開(kāi)期和衰敗期花瓣的相對(duì)表達(dá)量上升,其中半開(kāi)期花瓣的相對(duì)表達(dá)量最高(圖6A)。

CE .露色期the color-exposure stage; IF.初開(kāi)期initial flowering stage; HO.半開(kāi)期half opening stage; FB.盛開(kāi)期full blooming stage; ID.始衰期initial decay stage; DS.衰敗期decay stage。

為研究PoERF4基因在‘鳳丹’不同組織(葉片、莖、花萼和花瓣)相同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式,本研究采用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,PoERF4基因在葉片、莖、花萼和花瓣中均有表達(dá),具有組織特異性,在葉片中相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于莖、花萼和花瓣的相對(duì)表達(dá)量(圖6B)。

對(duì)于不同品種PoERF4基因在牡丹晚花品種‘蓮鶴’中表達(dá)量最高,為27.63;其次是‘鳳丹’中的表達(dá)量,早花‘鳳丹’突變株系中表達(dá)量最低(圖6C)。

為探明‘鳳丹’牡丹PoERF4基因響應(yīng)生長(zhǎng)素的調(diào)控作用,收取‘鳳丹’經(jīng)100 μmol/L生長(zhǎng)素處理下第1、2、4、8天的花瓣,提取所有組織RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,內(nèi)參基因?yàn)閍ctin基因。處理結(jié)果如圖6D所示,生長(zhǎng)素處理后的‘鳳丹’花瓣中,PoERF4基因在‘鳳丹’處理第8天時(shí),表達(dá)豐度最高,是第1天的101倍,這表明PoERF4基因的表達(dá)受響應(yīng)生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)且效果顯著(圖6D)。

3 討 論

植物葉、花、果實(shí)等器官的衰老脫落是一個(gè)高度程序化的過(guò)程,衰老相關(guān)基因和植物激素在此過(guò)程中共同調(diào)節(jié)脫落過(guò)程的進(jìn)行[20]。本研究從‘鳳丹’花瓣中成功分離出ERF4基因cDNA序列全長(zhǎng),在線預(yù)測(cè)分析表明PoERF4基因含有完整的開(kāi)放閱讀框,為747 bp,編碼248個(gè)氨基酸。對(duì)PoERF4基因編碼的蛋白分析發(fā)現(xiàn),PoERF4蛋白含有AP2超家族結(jié)構(gòu)域和特殊DNA結(jié)合位點(diǎn),屬于AP2/ERF家族,與茶(Camelliasinensis)[21]、紫花針茅(Stipapurpurea)[22]和蝴蝶蘭(Phalaenopsis)[23]等物種的AP2保守結(jié)構(gòu)域一致。在親疏水性上,PoERF4蛋白為親水性蛋白,與‘碭山酥梨’(Pyrus‘Dangshansuli’)[24]、楊樹(shù)(Populus)[25]、芹菜(Apiumgraveolens)[26]等物種預(yù)測(cè)到的ERF4蛋白特性一致。在結(jié)構(gòu)上,PoERF4蛋白均分布在膜外,不存在跨膜結(jié)構(gòu),表明該蛋白不屬于跨膜蛋白,與番茄(Solanumlycopersicum)[27]、小麥(Triticumaestivum)[28]等物種預(yù)測(cè)到的蛋白結(jié)構(gòu)一致。這些生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果將為牡丹PoERF4基因功能的進(jìn)一步探究奠定理論基礎(chǔ)。

利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)PoERF4基因在‘鳳丹’不同花期、不同組織、不同牡丹品種和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)后的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該基因在半開(kāi)期的花瓣中表達(dá)量最高,表明PoERF4基因可能在花發(fā)育中期發(fā)揮重要作用。PoERF4在不同組織中均有表達(dá),其中葉片表達(dá)量最高,在花萼和莖中表達(dá)量較低,表現(xiàn)出顯著的組織特異性,巴西橡膠(Heveabrasiliensis)HbERF4基因[29]、棉花(Gossypiumhirsutum)GhERF4基因[30]和辣椒(Capsicumannuum)AgERF4基因[31]均在葉片顯出組織特異性,有較高的表達(dá)量,推測(cè)其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮不同的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)在晚花品種‘蓮鶴’的PoERF1基因表達(dá)量顯著高于早花‘鳳丹’突變株系和‘鳳丹’。前人的研究表明,擬南芥ERF亞家族成員AtERF1基因可以抑制其在短日條件下開(kāi)花[32]。在玫瑰中沉默RhERF113基因加速了玫瑰花的衰老[33]。由此推測(cè)ERF亞家族中部分成員可能具有延緩植物衰老的作用。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族作為連接植物信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,可以調(diào)節(jié)乙烯、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸等植物激素的生物合成與轉(zhuǎn)錄過(guò)程,同時(shí)也對(duì)生長(zhǎng)素和茉莉酸等植物激素作出響應(yīng)[34]。PoERF4基因可受到外源生長(zhǎng)素處理的誘導(dǎo),表明該蛋白在參與花瓣脫落等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能受到生長(zhǎng)素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[13]。這些研究結(jié)果可為進(jìn)一步探究‘鳳丹’牡丹PoERF4基因的功能提供參考,為植物花期調(diào)控基因工程的研究提供新的候選基因。