3種牡丹花器官不同部位揮發(fā)性成分分析

徐 慧,姚霞珍,佟珂珂,邢 震,李 垚

(西藏農(nóng)牧學院資源與環(huán)境學院,西藏 林芝 860000)

牡丹(Paeonia×suffruticosa)屬芍藥科芍藥屬,是我國傳統(tǒng)名貴花卉,花大色艷、雍容華貴,素有“國色天香”“花中之王”的美稱,具有極高的觀賞價值。牡丹鮮花花香濃郁,花香是其觀賞性狀之一,有研究表明牡丹的揮發(fā)性成分主要包括萜烯類、醇類、苯環(huán)/苯丙素類和烷烴類,其組成和含量在不同品種和不同花發(fā)育階段差異明顯,從而導致不同牡丹品種花香的差異[1]。目前牡丹的育種目標大多集中于花色和花型,花香性狀的定向選育未得到重視,牡丹花香的研究主要集中在不同品種牡丹上,而對野生牡丹香氣成分的研究較少[2-3]。Zhang等[4]分析了紫斑牡丹(Paeoniarockii)、紫牡丹(P.delavayi)、黃牡丹(P.lutea)花瓣精油中的化學成分,研究表明黃牡丹和紫牡丹精油中含有較多的萜類化合物,主要包括氧化芳樟醇、異植醇、法尼醇和植醇,同時含有較顯著的芳香成分,釋放出藥草清香。另有研究表明,紫斑牡丹揮發(fā)性成分的主要組分是6,9-十七烷二烯,呈現(xiàn)出濃郁的脂粉香,在對部分紫斑牡丹品種花瓣揮發(fā)性成分測定后發(fā)現(xiàn),多數(shù)樣品的花瓣揮發(fā)性主成分與野生紫斑牡丹一致,原因主要為栽培紫斑牡丹遺傳背景較為單一,因此穩(wěn)定遺傳了野生紫斑牡丹花香的特征[5]。Luo等[6]在9種野生牡丹中共檢測出124種化合物,通過主成分分析和聚類分析將9種牡丹劃分為兩個集群,四川牡丹(P.decomposita)、卵葉牡丹(P.qiui)、紫斑牡丹(P.rockii)、矮牡丹(P.jishanensis)和楊山牡丹(P.ostii)為一個集群,黃牡丹(P.lutea)、紫牡丹(P.delavayi)、大花黃牡丹(P.ludlowii)、狹葉牡丹(P.potanini)為另一集群,兩個集群在地理分布上與野生牡丹分布相一致,通過對香氣成分的研究進一步揭示了野生牡丹種間的親緣關系。

大花黃牡丹是西藏特有叢生落葉花灌木,花大色艷、植株高大,具有極高的觀賞和藥用價值,目前處于瀕危狀態(tài),已被列為國家二級保護植物[7-8];黃牡丹為我國西南特有野生牡丹[9],我國牡丹育種者從20世紀末開始利用黃牡丹作為重要的育種親本開展遠緣雜交育種工作,并培育出了多個優(yōu)良雜交后代[10];楊山牡丹是江南牡丹品種群的主要起源種,參與了中原牡丹、西南牡丹品種群的形成[11-13]。3種野生牡丹均是我國重要的花卉種質資源,感官上香氣各異,大花黃牡丹的香氣較為清新溫和,黃牡丹呈現(xiàn)出濃郁甜香,楊山牡丹的香氣較為清幽淡雅。本研究采用頂空-氣相色譜質譜聯(lián)用(HS-GC-MS)技術對上述3種牡丹花器官不同部位的揮發(fā)性成分進行分析與鑒定,以明確3種牡丹花器官揮發(fā)性成分釋放的關鍵部位并得出各部位在揮發(fā)性成分組成和含量上的差異,對香氣獨特的牡丹種質資源進行評價和篩選,以期為牡丹花香育種、資源開發(fā)利用等后續(xù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試材

試驗材料為具有特殊香氣的3種野生牡丹,即多年生大花黃牡丹(西藏特有野生種)、黃牡丹(引種自西藏林芝鎮(zhèn))、楊山牡丹(引種自四川成都市)花器官的不同部位,包括整花、花瓣、雄蕊,3種牡丹均于2021年5月初采自西藏自治區(qū)林芝市。主要儀器為氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(日本島津,GC-MS QC2030),裝有NIST 17譜庫檢索系統(tǒng),色譜柱型號為SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2 揮發(fā)性成分提取

3種牡丹花期相近,選擇晴天11:00左右采集盛開期且長勢良好的3種牡丹花各3朵,密封保存迅速帶回實驗室。隨機稱取花瓣、雄蕊樣品2.6 g,大花黃牡丹、黃牡丹和楊山牡丹整花樣品進行去除花萼、花柄等無香部位的處理,樣品質量分別為4.5、3.5和4.8 g。將花瓣與雄蕊樣品置于20 mL、整花樣品置于100 mL的頂空進樣瓶中,密封后放入自動頂空進樣儀中,進樣體積設置為2 000 μL,60 ℃下預熱并平衡30 min后取樣進行GC-MS分析。

1.3 GC-MS條件

GC條件:進樣口溫度230 ℃,進樣模式為不分流進樣,進樣時間3 min;載氣為He(99.999%),柱流量0.8 mL/min;色譜柱梯度升溫,起始溫度25 ℃,保留6 min,以3 ℃/min的速率升溫至40 ℃并保留4 min,再以8 ℃/min的速率升溫至180 ℃并保留2 min,最后以15 ℃/min的速率升溫至230 ℃并保留7 min。色相總分析時間為44.83 min。

MS條件:電離方式為EI;離子源溫度200 ℃,接口溫度230 ℃;溶劑延遲時間4 min;掃描模式為全模式掃描,掃描質量范圍45～500 amu。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GC自帶的實時分析軟件處理實驗數(shù)據(jù),將所得各樣品的譜圖與NIST 17譜庫中標準物質的譜圖進行比對,并結合相關文獻進行人工解譜,僅報道相似度大于90%的物質?；诿娣e歸一化法,利用各個物質的峰面積占總峰面積的百分比來表示該物質的相對含量。使用Excel 2013軟件對揮發(fā)性成分的數(shù)量和相對含量進行統(tǒng)計分析,使用SIMCA 14.1進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。采用R軟件及Origin 9.1繪圖。

2 結果與分析

2.1 3種牡丹花器官各部位揮發(fā)性成分分類

從3種牡丹花器官各部位揮發(fā)性成分種類及其相對含量(表1)可知,大花黃牡丹、黃牡丹、楊山牡丹整花中各檢出揮發(fā)性物質9、6、9類,花瓣中各檢出揮發(fā)性物質8、8、6類,雄蕊中各檢出揮發(fā)性物質8、10、9類。3種牡丹雄蕊中的烷烴類化合物均遠高于整花與花瓣,楊山牡丹雄蕊中烷烴類化合物相對含量為41.58%,種類多達15種,其中檢測出的十四烷、十五烷、3-甲基十五烷、十六烷、十七烷均為牡丹花香中主要的脂肪酸衍生物。烯烴類化合物大量存在于3種牡丹的各部位,尤其是黃牡丹整花中的烯烴類化合物相對含量高達80.37%,花瓣中高達69.32%,在黃牡丹花瓣中檢出相對含量較高的揮發(fā)性物質為α-蒎烯(34.23%)、β-古巴烯(25.39%)、芳樟醇(13.15%)、反式-氧化芳樟醇(呋喃型)(9.82%)、苯乙酮(4.47%)。

表1 3種牡丹花器官各部位揮發(fā)性成分種類及其相對含量

芳香族類化合物1,3,5-三甲氧基苯存在于楊山牡丹花器官各部位中。醇類化合物主要存在于大花黃牡丹和黃牡丹花器官中,楊山牡丹相較于其他兩種牡丹而言,花器官中的醇類化合物相對含量較低。酮類化合物大量存在于大花黃牡丹花器官中,大花黃牡丹雄蕊中的酮類化合物相對含量高達32.33%。酯類化合物相對含量最高的部位為大花黃牡丹的雄蕊,共檢出7種酯類化合物,相對含量為12.25%,酯類多具有花香、水果香氣,由醇類和酸類通過酯化反應生成[3]。酸類化合物共檢出6種,僅在大花黃牡丹整花、黃牡丹花瓣、黃牡丹雄蕊、楊山牡丹整花中被檢出,且相對含量均低于1%。甾類化合物共檢測出5種,相對含量最高的為大花黃牡丹的花瓣(表1)。

2.2 3種牡丹花器官揮發(fā)性成分分析

從大花黃牡丹、黃牡丹、楊山牡丹的不同部位中共檢測出揮發(fā)性成分147種,包括烷烴類化合物28種,酯類化合物28種,烯烴類化合物23種,醇類、醛類、酮類化合物各12種,酸類、芳香族類化合物各6種,甾類化合物5種,其他類化合物15種,總相對含量從96.92%到100%。3種牡丹花朵不同部位香氣中檢測到的揮發(fā)性成分與數(shù)量存在較大差異,化合物名稱、保留時間及各成分的相對含量見附表1(參見http://nldxb.njfu.edu.cn)。

3種牡丹花器官不同部位揮發(fā)性成分分析 附表1

2.2.1 大花黃牡丹(P.ludlowii)

大花黃牡丹花器官香氣成分在3種牡丹中最為復雜,共檢出揮發(fā)性物質69種,其中整花含有39種,花瓣含有27種,雄蕊含有29種。整花中的揮發(fā)性物質主要為醛類、酮類和烯烴類化合物,相對含量均大于22%。其中相對含量較高的醛類物質主要包括6,6-二甲基雙環(huán)[3.1.1]庚烷-2-甲醛、壬醛、辛醛、庚醛;酮類物質以苯乙酮、茉莉酮、7-亞乙基-雙環(huán)[3.3.0]辛-3-酮為主;烯烴類化合物主要為α-蒎烯、β-古巴烯、β-月桂烯、D-檸檬烯。花瓣中以醇類化合物相對含量最高,達到28.14%,酮類和烯烴類化合物相對含量也均高于21%,3類化合物中相對含量較高的物質是β-古巴烯、苯乙酮、芳樟醇,相對含量分別為20.21%、19.55%、13.65%。雄蕊中揮發(fā)性物質以酮類、醇類和烷烴類化合物為主,其中苯乙酮和芳樟醇的相對含量均大于16%,辛烷和大根香葉烯D的相對含量也較高,分別達到9.38%和7.55%,而在整花中大量存在的6,6-二甲基雙環(huán)[3.1.1]庚烷-2-甲醛,雄蕊中未檢出,其在花瓣中相對含量也較低,提示該物質可能大量存在于整花中的其他部位,如雌蕊部位。在大花黃牡丹花器官3部位中均大量存在的物質是苯乙酮和芳樟醇。大花黃牡丹3個部位中的共有成分為9種(圖1A),重合率僅為13%,說明3個部位成分差異較大,只在整花中檢測到的成分有22種,花瓣中獨有的成分為13種,雄蕊的獨有成分主要有17種,整花與花瓣、雄蕊中成分重合率均較低且相近,說明大花黃牡丹花瓣和雄蕊部位均為花朵香氣做出一定貢獻。

圖1 3種牡丹花器官揮發(fā)性成分維恩圖Fig.1 The Venn diagram of volatile components

2.2.2 黃牡丹(P.lutea)

黃牡丹花器官中共檢出揮發(fā)性物質53種,在整花、花瓣、雄蕊中各檢出30、28、38種物質,有別于其他兩種牡丹的是,黃牡丹雄蕊中檢出的物質種類最多。黃牡丹整花中檢測出烯烴類化合物的相對含量高達80.37%,其中α-蒎烯的相對含量為67.33%?；ò曛械膿]發(fā)性物質以烯烴類和醇類化合物為主,相對含量分別為69.32%、23.43%,其中α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇的相對含量分別為34.23%、25.39%、13.15%。黃牡丹雄蕊中相對含量最高的也為烯烴類化合物,其中α-蒎烯、β-古巴烯的相對含量均高于15%,且雄蕊中烷烴及酯類化合物相對含量遠高于其他兩個部位,其中辛烷的相對含量高達26.69%,5種酯類化合物的相對含量為2.59%,同時檢測出了在其他2部位不存在的甾類化合物1種和其他類化合物3種。黃牡丹花器官3個部位中均含有的成分有15種(圖1B),重合率為28.3%,花瓣與整花部位共有物質占整花物質的76.7%,說明黃牡丹花瓣與整花的共有成分構成了黃牡丹的基本香氣輪廓,共有成分中相對含量較高的α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇主導了黃牡丹的特征香型。

2.2.3 楊山牡丹(P.ostii)

楊山牡丹花器官中共檢出61種揮發(fā)性物質,其中整花40種,雄蕊35種,花瓣28種,花瓣中檢出的化合物種類最少。楊山牡丹整花中烯烴類化合物相對含量為73.17%,其中α-蒎烯、羅勒烯相對含量分別為50.19%、19.05%,α-蒎烯僅在整花中被檢出,花瓣和雄蕊中未檢出,同時酸類化合物僅在整花中檢測出2種,花瓣和雄蕊中未檢出?；ò曛袡z出的烯烴類物質相對含量高達88%,其中羅勒烯的相對含量為81.58%,并且在楊山牡丹3部位的總離子流圖中,花瓣中的羅勒烯豐度值遠高于其他揮發(fā)性物質,提示楊山牡丹花瓣的主要賦香物質為羅勒烯。楊山牡丹雄蕊中檢出的烷烴類化合物相對含量最高,為41.58%,烯烴類化合物次之,相對含量為35.82%,其中羅勒烯、十五烷、十三烷、辛烷、十七烷相對含量較高。楊山牡丹花器官3個部位共有的揮發(fā)性成分有16種(圖1C),主要為烯烴類、烷烴類、醛類和酯類化合物,重復率為26.2%,共有的物質主要有羅勒烯、十五烷、十七烷、(E)-14-十六烯醛、(Z)乙酸-5-十二烯醇酯。整花與花瓣、雄蕊中檢出的共有物質占整花物質的47.5%、55.0%,整花中獨有物質為15種,花瓣中獨有的物質為8種,雄蕊中獨有物質為12種。

2.3 揮發(fā)性成分PCA和PLS-DA分析

為進一步分析3種牡丹花器官中揮發(fā)性成分的差異,采用PCA對3種牡丹各樣品中揮發(fā)性成分的相對含量進行分析[14]。其中主成分1、主成分2和主成分3的方差貢獻率分別為37.7%、20.8%和15.9%,所有樣品點均在95%置信區(qū)間內(nèi)。3種牡丹各樣品分布在不同的區(qū)間且呈現(xiàn)出良好的聚類,大花黃牡丹雄蕊、花瓣、整花與主成分1呈正相關,楊山牡丹雄蕊、花瓣、整花與主成分1呈負相關,黃牡丹花瓣、雄蕊、整花與主成分2呈正相關;3種牡丹在PC3方向上存在重疊,區(qū)分不顯著(圖2A、2B)。3種牡丹花器官各部位中的揮發(fā)性成分存在一定差異,大花黃牡丹和黃牡丹花器官中的揮發(fā)性物質差異相對較小,可能與3種牡丹歸屬于不同牡丹亞組有關,大花黃牡丹和黃牡丹屬于肉質花盤亞組,而楊山牡丹屬于革質花盤亞組。

圖D中揮發(fā)性成分序號同附表1。No. in Fig D. are the same as those in schedule 1 (http://nldxb.njfu.edu.cn).

從PCA相應的載荷圖(圖2C)可以看出,芳樟醇、苯乙酮、苯甲酸甲酯、乙醇、茉莉酮、十甲基環(huán)五硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷、β-古巴烯等與主成分1有較大的正相關,十七烷、反式-β-羅勒烯、Myroxide、2-甲基十六烷、(Z)乙酸-5-十二烯醇酯、(E)-14-十六烯醛、十五烷等與主成分1有較大的負相關,(+)-雙環(huán)大根香葉烯、Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一碳三烯、萘、反式-氧化芳樟醇(呋喃型)、石竹烯、古巴烯、α-蒎烯與主成分2有較大的正相關。結合圖2B可知,以苯乙酮、茉莉酮、α-蒎烯、(+)-雙環(huán)大根香葉烯、Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一碳三烯、石竹烯、古巴烯、α-蒎烯、β-古巴烯為主的酮類和烯烴類化合物是導致大花黃牡丹和黃牡丹香氣差異較大的物質,以十七烷、十五烷、十三烷、十四烷、反式-β-羅勒烯、Myroxide、羅勒烯為主的烷烴類和烯烴類化合物是導致楊山牡丹香氣有別于其他2種牡丹的主要物質。

在利用PCA觀察到3種牡丹樣本間的分類趨勢后,為進一步了解引起樣本間差異的變量,采用了PLS-DA對影響分組趨勢的標志性差異成分進行了判別分析。變量投影重要性(variable importance in the projection,VIP,式中記為VVIP)是PLS-DA模型對不同化合物的量化評分,VIP值越大,表明相對應的變量對3種牡丹分類的貢獻率越大。由PLS-DA模型VIP得分圖(圖2D)可知,共有15種揮發(fā)性物質可作為區(qū)分3種牡丹的差異性成分(VVIP>1,P<0.05),包括苯乙酮、芳樟醇、反式-氧化芳樟醇(呋喃型)、α-蒎烯、β-古巴烯、羅勒烯、反式-β-羅勒烯、十五烷等,差異性成分在3種牡丹花器官中的相對含量差異較大,這些物質在不同種牡丹中的含量差異對相應牡丹香氣特征的形成具有重要意義。

3 討 論

植物花香是由花器官釋放出來的揮發(fā)性混合氣體物質[15],揮發(fā)性物質種類的差異性可導致植物花香的不同。大多數(shù)植物的花瓣是花香的主要釋放部位,其他器官也能散發(fā)少量香氣,如雌蕊、雄蕊、蜜腺[16]。在毛茛屬植物Rannunculusacris中,花瓣和雄蕊對整朵花的花香具有同樣重要的貢獻[17];山茶‘克墨瑞大牡丹’(Camellia‘Kramer’s supreme’)相同質量的雄蕊香氣揮發(fā)量是花瓣的1.5倍[18]。本研究發(fā)現(xiàn)3種牡丹雄蕊中檢測出的揮發(fā)性物質種類均多于花瓣,同時3種牡丹雄蕊中烷烴類化合物的相對含量均遠高于整花與花瓣,推測雄蕊可能是烷烴類化合物的重要合成部位?；跈z出的147種揮發(fā)性成分相對含量構建的PCA可實現(xiàn)將大花黃牡丹、黃牡丹、楊山牡丹不同部位的樣品準確分類,對揮發(fā)性成分進行研究可為后續(xù)牡丹組植物的親緣關系及系統(tǒng)發(fā)育研究提供一定參考,通過PLS-DA模型篩選出的15種差異性成分在3種牡丹花器官中的相對含量存在差異,這些成分對不同種牡丹香氣特征的形成具有重要作用。

研究表明,苯乙酮是茶花(Camelliasinensis)的特征香味化合物[19],同時也是日化香精、定香劑、食用香精等的主要組分[20]。芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類,是典型的花香韻物質[21],廣泛存在于植物精油中,具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)靜和保護神經(jīng)等作用[22],是食品、藥品、日化香精行業(yè)的重要原料[23]。苯乙酮和芳樟醇給大花黃牡丹帶來較為濃烈的花香氣息。苯乙酮對大黃蜂有明顯的趨避現(xiàn)象,大黃蜂不會為揮發(fā)性有機化合物(VOC,volatile organic compounds)中含有苯乙酮的Antirrhinummajusssp.pseudomajus授粉[24];在3個鄰近的毛地黃(Digitalispurpurea)、吊鐘柳(Penstemondigitalis)種群中,傳粉者對花香的選擇呈現(xiàn)出顯著的種群間差異,揮發(fā)性成分中的芳樟醇是影響傳粉者行為的重要原因[25]。傳粉者對VOC的特異性選擇可驅動植物香味的釋放模式與組分發(fā)生改變,因此部分VOC可作為吸引特定傳粉者的潛在工具[19]。大花黃牡丹的主要香氣化合物為苯乙酮和芳樟醇,在其3部位中均檢測出較高相對含量的苯乙酮和芳樟醇,未來可基于這兩種成分針對性地開發(fā)利用大花黃牡丹資源。

黃牡丹的主要香氣化合物為α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇,在黃牡丹3部位均大量存在的α-蒎烯屬草香韻,具有類似于松木、松脂的香氣[21],α-蒎烯被大量用于合成松油醇、里那醇等香料[26-27],同時具有提神醒腦和活血等作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)黃牡丹花瓣精油具有較強的抗氧化力,對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-聯(lián)氫-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)的清除能力強[4],因此黃牡丹具有巨大的開發(fā)價值,可作為天然抗氧化劑和香精香料應用于制藥和日化產(chǎn)業(yè)。

楊山牡丹的主要香氣化合物為羅勒烯、α-蒎烯、十五烷。羅勒烯具有花香、草香并伴有橙花油氣息[29],屬于無環(huán)單萜類化合物,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用[30],同時具有多種生物學功能,包括吸引授粉昆蟲與誘導植物抗性,有研究表明植物在經(jīng)過羅勒烯的處理后,可以啟動廣譜性防御應答反應,從而增強抵抗外界刺激的能力[31-33]。羅勒烯在楊山牡丹花瓣中的相對含量高達81.58%,推測楊山牡丹的主要賦香部位在花瓣,花瓣部位極具開發(fā)與利用價值。

由于栽培環(huán)境和實驗方法等方面的不同,本研究檢測出的3種牡丹花揮發(fā)性成分與前人的研究有一定差別。將本試驗的研究結果與Luo等[6]的研究進行對比,均發(fā)現(xiàn)大花黃牡丹和黃牡丹花瓣中含有較高含量的芳樟醇,嗅覺閾值低的芳樟醇賦予大花黃牡丹和黃牡丹花朵較為強烈的花香屬性;在楊山牡丹花中均檢測出相對含量較高的十五烷(蠟味[6]),結合檢出的其他揮發(fā)性成分共同賦予了楊山牡丹草香和蠟質香味屬性。明確不同種類牡丹的揮發(fā)性成分,可為后續(xù)挖掘牡丹香氣基因資源和開發(fā)利用牡丹價值提供理論基礎?，F(xiàn)階段關于牡丹的花香成分釋放規(guī)律、花香遺傳規(guī)律、不同花香成分生物合成途徑以及揮發(fā)性成分的嗅覺閾值等方面的研究內(nèi)容均較少,在后續(xù)研究中可進一步結合各揮發(fā)性成分的嗅覺閾值對牡丹花香特征進行鑒定與評價。