利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建水稻OsPUX2突變體

高上 滿淼淼 趙華 張麗娜 王加峰

摘要 ［目的］U-box蛋白是一類決定靶標(biāo)蛋白特異性的E3泛素連接酶（少部分屬于泛素鏈聚集因子-E4），在植物抗病、抗逆和生長(zhǎng)發(fā)育各階段都發(fā)揮著重要作用。為揭示U-box蛋白家族基因OsPUX2在水稻防御反應(yīng)中的具體生物學(xué)功能，利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)對(duì)OsPUX2基因進(jìn)行編輯。［方法］在OsPUX2第1外顯子設(shè)計(jì)1個(gè)20 bp的編輯靶點(diǎn)，構(gòu)建了OsPUX2基因敲除載體pRGEB32-OsPUX2-gRNA載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法侵染水稻Pik-H4 NIL愈傷組織，經(jīng)潮霉素檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，并對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行靶點(diǎn)區(qū)域序列進(jìn)行PCR和測(cè)序分析，分析ospux2的突變類型。［結(jié)果］成功獲得了ospux2的敲除突變體材料，對(duì)突變類型的分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因編輯后代共存在7種突變類型，以缺失突變?yōu)橹?，其中一種純合突變類型在OsPUX2第一個(gè)外顯子的第115號(hào)堿基處缺失了一個(gè)C堿基，導(dǎo)致蛋白的翻譯在第84個(gè)氨基酸處提前終止。［結(jié)論］該研究獲得ospux2突變株系對(duì)進(jìn)一步研究該基因的功能具有重要意義。

關(guān)鍵詞 水稻；U-box；OsPUX2；CRISPR/Cas9；基因編輯

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2023）09-0073-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.018

Abstract ［Objective］Ubox proteins are a class of E3 ubiquitin ligases that determine the specificity of target proteins， play an important role in plant disease resistance， stress resistance and all stages of growth and development. In order to reveal the specific biological function of the Ubox protein family gene OsPUX2 in rice defense response， the OsPUX2 gene was edited by CRISPR/Cas9 editing technology. ［Method］A 20-bp editing target was designed in the first exon of OsPUX2 and the pRGEB32OsPUX2gRNA vector was constructed. Rice PikH4 NIL callus was infected by Agrobacteriummediated transformation and tested with hygromycin. The T0 generation transgenic plants were subjected to PCR and sequencing analysis of the target region sequence to analyze the mutation type of ospux2. ［Result］The knockout mutant of ospux2 was successfully obtained. There were a total of 7 mutation types in the transgenic edited progeny， which are mainly deletion mutations. One of the homozygous mutation types with a C base deletion at the +115 bp of the first exon of OsPUX2 gene leads to termination of protein translation at 84 aa. ［Conclusion］The ospux2 mutant strain obtained in this study is of great significance to further study the function of this gene.

Key words Rice；Ubox；OsPUX2；CRISPR/Cas9；Gene editing

基金項(xiàng)目 2021年省級(jí)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（2021KJ382）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南現(xiàn)代生物種業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2105-000000-20-03-457451）。

作者簡(jiǎn)介 高上（1999—），男，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：水稻抗性。*通信作者，副研究員，博士，從事水稻病害研究。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要途徑之一，參與生物體內(nèi)絕大多數(shù)的生理活動(dòng)，通過(guò)降解靶蛋白水平調(diào)控植物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及其對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)［1-2］。泛素-蛋白酶體系降解途徑由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體組成，其中E1負(fù)責(zé)激活泛素，E2直接將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)，或者同泛素一起轉(zhuǎn)移給E3連接酶，形成被蛋白酶體識(shí)別的底物后被降解［3］。泛素分子對(duì)靶蛋白的特異性識(shí)別主要依賴于E3泛素連接酶，E3是一個(gè)大的、多樣化的蛋白群，根據(jù)基序的不同，可分為4類：HECT結(jié)構(gòu)域、U-box結(jié)構(gòu)域、RING-finger結(jié)構(gòu)域、Cullin-RING結(jié)構(gòu)域［4-5］。其中U-box蛋白質(zhì)廣泛存在于酵母到人類的大量真核生物中［6］。據(jù)報(bào)道，植物中U-box蛋白質(zhì)在抵抗生物脅迫與非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］，迄今為止，大部分水稻U-box蛋白質(zhì)的功能及其作用機(jī)制尚不清楚，通過(guò)利用基因編輯技術(shù)對(duì)靶基因OsPUX2進(jìn)行定點(diǎn)編輯，為解析該類蛋白質(zhì)在植物抗病抗逆方面的功能具有重要意義。

目前已經(jīng)有大量U-box蛋白質(zhì)參與抗病抗逆過(guò)程的報(bào)道，如在植物抗病反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用的AtSPL11、AtPUB12/AtPUB13［7-9］及在植物抗病中發(fā)揮著正調(diào)控作用的CMPG1、AtPUB17等［10-11］。水稻OsPUB44正調(diào)控水稻PTI及其對(duì)白葉枯病的抗性［12］。AtPUB22和AtPUB23能夠協(xié)同負(fù)調(diào)控植物的干旱脅迫反應(yīng)，而AtPUB30蛋白能調(diào)控植物耐鹽作用［13］。此外，水稻OsPUB15能夠降低活性氧暴發(fā)，從而正調(diào)控鹽脅迫反應(yīng)［14］。AtPUX1對(duì)于清除無(wú)功能的AtCDC48具有重要作用，可介導(dǎo)多種細(xì)胞活動(dòng)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜的同型融合、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡［15］。雖然大量U-box蛋白參與調(diào)控植物各種生理活動(dòng)被研究報(bào)道，植物許多U-box蛋白的功能及其作用機(jī)制研究也取得了較大進(jìn)展，但仍缺乏系統(tǒng)深入研究。水稻中OsPUX2與AtPUX2親緣關(guān)系較近，但其具體功能尚不清楚。

CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種高效的基因編輯工具，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、玉米、番茄等農(nóng)作物中，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶基因的定向編輯，在分子育種方面也顯示了巨大的應(yīng)用潛力［16-18］。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯是由gRNA與Cas9蛋白組成復(fù)合物實(shí)現(xiàn)的，gRNA負(fù)責(zé)定位與其有互補(bǔ)關(guān)系的DNA雙鏈，Cas9核酸酶負(fù)責(zé)切割DNA雙鏈產(chǎn)生雙鏈斷裂（Double strand breaking，DSB），經(jīng)非同源末端連接修復(fù)（nonhomologous endjoining，NHEJ）后，產(chǎn)生一系列插入、缺失及堿基替換突變，從而創(chuàng)造出一系列的突變體，以便于進(jìn)行基因功能的研究。由于CRISPR/Cas9 技術(shù)操作簡(jiǎn)單，效率較高，目前已被廣泛應(yīng)用于各類生物基因功能研究中［19］。

筆者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)編輯水稻OsPUX2基因，構(gòu)建水稻OsPUX2的突變體材料，以期為后續(xù)開(kāi)展OsPUX2參與的具體調(diào)控通路的功能解析奠定重要的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以粳稻Pik-H4 NIL為受體材料。 Cas9-gRNA表達(dá)載體pRGEB32購(gòu)自Addgene。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 靶點(diǎn)的選擇及gRNA設(shè)計(jì)

利用CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)在線設(shè)計(jì)平臺(tái)（http：//skl.scau.edu.cn/）［20］設(shè)計(jì)OsPUX2編輯靶點(diǎn)，查找符合GN19NGG的序列。其中，GN19為20個(gè)堿基的靶點(diǎn)序列，NGG（N表示任意堿基）為識(shí)別靶序列的原初間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif，PAM）。優(yōu)選靶位點(diǎn)位于編碼序列5′端，與潛在脫靶位點(diǎn)的差異在3個(gè)堿基以上，以保證編輯的特異性。選擇第1外顯子設(shè)計(jì)1個(gè)20 bp的編輯靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)2條互補(bǔ)靶點(diǎn)引物OsPUX2-E1gRNAF與OsPUX2-E1gRNAR，其靶點(diǎn)引物序列分別為TGCAGATGATCCGTGGCAAGATGCCAAGGGGACTCGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAG（5′—3′）和CTATTTCTAGCTCTAAAACGGCGAGTCCCCTTGGCATCTTGCCACGGATCATCTGCA（5′—3′）。靶位點(diǎn)的特異性通過(guò)水稻全基因組BLAST分析進(jìn)行比對(duì)。

1.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建

首先將Cas9蛋白表達(dá)載體pRGEB32用BsaI進(jìn)行單酶切，凝膠回收載體片段，將2條互補(bǔ)靶點(diǎn)引物OsPUX2-E1gRNAF與OsPUX2-E1gRNAR進(jìn)行退火反應(yīng)，將其與凝膠回收的pRGEB32載體片段利用重組酶進(jìn)行重組連接反應(yīng)（反應(yīng)體系：4 μL 5×CE Ⅱ Buffer、2 μL Exnase Ⅱ、0.03 pmol pRGEB32、0.06 pmol 插入片段，補(bǔ)ddH2O至20 μL；37 ℃ 30 min），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后對(duì)靶點(diǎn)序列利用U3gRNA-F與UBI-R（表2）進(jìn)行菌落PCR鑒定，并進(jìn)行測(cè)序分析，取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，并侵染轉(zhuǎn)化Pik-H4 NIL愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選獲得再生T0代植株。用CTAB法提取植株葉片基因組DNA，利用OsPUX2-kotest-F與OsPUX2-kotest-R（表2）對(duì)靶位點(diǎn)區(qū)域DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（產(chǎn)物約408 bp）鑒定突變類型。引物U3gRNA-F、UBI-R、OsPUX2-kotest-F、OsPUX2-kotest-R 的堿基序列分別為GTTGGAAACCACGTGATGT（5′—3′）、ACTGTAATTTCTTCTGGCTGG（5′—3′）、ACAACAGGCAAATCAGGAGC（5′—3′）、GGAACGACAAGTACAGGAAGG（5′—3′）。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA靶點(diǎn)選擇和序列設(shè)計(jì)

OsPUX2含有3個(gè)外顯子，CDS含有615個(gè)堿基，編碼205個(gè)氨基酸（aa），UBX結(jié)構(gòu)域位于OsPUX2的C端區(qū)域（121～205 aa）。為完全破壞OsPUX2基因的功能，利用CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)在線設(shè)計(jì)平臺(tái)（http：//skl.scau.edu.cn/）在OsPUX2第1個(gè)外顯子區(qū)域選擇一個(gè)靶點(diǎn)（5′—AGATGCCAAGGGGACTCGCC CGG—3′）進(jìn)行定點(diǎn)編輯，靶位點(diǎn)位于編碼區(qū)+98到+118處（圖 1）。將設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，證明其具有較好的特異性。

2.2 OsPUX2基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建

首先凝膠回收BsaI酶切后的pRGEB32載體片段，將2條互補(bǔ)靶點(diǎn)引物OsPUX2-E1gRNAF與OsPUX2-E1gRNAR退火后直接將其與BsaI酶切后的pRGEB32載體片段利用重組酶進(jìn)行重組連接反應(yīng)，重組產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆用引物U3gRNA-F、UBI-R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，得到500 bp的目的條帶（圖2）。對(duì)陽(yáng)性菌落質(zhì)粒利用U3gRNA-F進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明OsPUX2基因的1個(gè)靶點(diǎn)序列克隆至pRGEB32載體，成功獲得pRGEB32-OsPUX2-gRNA的表達(dá)載體，可以進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。

2.3 OsPUX2基因的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株鑒定

pRGEB32-OsPUX2-gRNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻材料Pik-H4 NIL愈傷組織中，經(jīng)過(guò)加有潮霉素的培養(yǎng)基篩選后，將陽(yáng)性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；進(jìn)一步生根培養(yǎng)得到T0代OsPUX2基因的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株。最終獲得20個(gè)潮霉素陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株（圖3）。

2.4 編輯突變體的突變類型分析

首先利用引物（OsPUX2-kotest-F與OsPUX2-kotest-R）對(duì)潮霉素基因檢測(cè)為陽(yáng)性的植株OsPUX2編輯靶點(diǎn)區(qū)域DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明，所有的CRISPR/Cas9編輯突變體都能擴(kuò)增出408 bp左右的目的條帶（圖4）。對(duì)相應(yīng)突變體靶位點(diǎn)區(qū)域的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，并以野生型序列作為參考，對(duì)OsPUX2轉(zhuǎn)基因株系中各靶位點(diǎn)序列進(jìn)行比較，并利用解碼網(wǎng)站（http：∥skl.scau.edu.cn/dsdecode/）對(duì)全部轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明（圖5），ospux2的突變頻率高達(dá)85%，共存在7種突變類型，多為剪切位點(diǎn)處產(chǎn)生的堿基缺失突變，分別有-1、-2、-4、-5、-23、-23及-2/+1（缺失/插入）類型，分別占編輯類型總數(shù)的51.7%、10.3%、10.3%、13.7%、3.4%、6.9%和3.4%，其中，單堿基缺失占比最高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，含有單堿基缺失（CDS中115號(hào)堿基C缺失）的突變體有6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均為純合缺失突變（ospux2-1、ospux2-2、ospux2-11、ospux2-19、ospux2-21和ospux2-25），該堿基缺失導(dǎo)致該蛋白的翻譯在第84個(gè)氨基酸處提前終止。綜上分析可以發(fā)現(xiàn)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)OsPUX2基因的定點(diǎn)編輯，并獲得了6株含有1個(gè)堿基的純合突變株系，而雜合突變株系需要在T1、T2代繼續(xù)與測(cè)序進(jìn)行比較分析。

3 討論

CRISPR/Cas9是一項(xiàng)比TALEN和ZFN技術(shù)優(yōu)勢(shì)更強(qiáng)的基因編輯技術(shù)，能夠精確地對(duì)植物基因組的靶標(biāo)部位進(jìn)行編輯，具有較高的特異性和編輯效率。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)為植物基因工程研究提供了新工具，也極大推動(dòng)了植物中復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析與遺傳育種研究。

U-box蛋白質(zhì)多參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫與非生物脅迫過(guò)程的調(diào)控［9，12-13］。前期研究發(fā)現(xiàn)，OsPUX2基因可能參與對(duì)稻瘟病抗性的調(diào)控，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，OsPUX2基因與擬南芥的AtPUX2同源性高，但具體的功能仍不清楚。為進(jìn)一步研究OsPUX2基因在抗病途徑中的功能，該研究利用單靶點(diǎn)gRNA對(duì)水稻的OsPUX2基因進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，獲得了一系列不同缺失類型的ospux2突變體，ospux2的突變頻率高達(dá)85%，其中，ospux2單堿基缺失突變類型占51.7%，該堿基（115號(hào)堿基C）缺失導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，突變株系中有6株含有該種類型的純合突變。其他類型的突變包括多堿基缺失及插入株系都處于雜合狀態(tài)，需要在T1代或T2代予以分離出來(lái)，這些類型的突變中除3堿基缺失會(huì)造成整碼突變外，其他多造成蛋白翻譯的提前終止。以上功能缺失型突變體的獲得為進(jìn)一步研究OsPUX2基因的功能提供了重要的遺傳材料。

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