項痹通顆粒調(diào)控PPAR-γ/NF-κB通路改善大鼠頸后肌炎癥損傷的研究

楊淑荃 范德輝 林穎 岳挺 楊佳曼 羅孟西 歐志文 鐘毅恒

中國頸椎病發(fā)病率約為13.76%[1-2],部分國家甚至高達46.3%[3]。目前頸椎不穩(wěn)學說之生物力學失衡是較為公認的發(fā)病機制[4],“動力失衡為先,靜力失衡為主”,即頸部肌肉群構(gòu)成的動力系統(tǒng)失衡后,會破壞脊椎關節(jié)構(gòu)成的靜力平衡系統(tǒng)。臨床常見的頸部僵痛多以頸椎伸屈受限、頸后部疼痛,低頭時加重為主癥,即頸后肌病損特征。頸肌受損、血循阻滯、組織缺氧、代謝紊亂,誘發(fā)一系列炎癥反應。查閱文獻,干預頸后肌炎癥損傷的研究不乏針刀治療[5],但1周1～2次,無療效持續(xù)性,且部分患者懼怕疼痛、不以針刀為首選。中藥內(nèi)服1天2次、連續(xù)7天,可維持治療效應,作用溫和無痛閾,被廣大患者所接受。

桂枝加葛根湯為醫(yī)圣張仲景治療頸項僵痛的首選方。研究發(fā)現(xiàn),此方可抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)基因表達[6],降低與炎癥正相關的PGE2含量[7],但所取標本多為靜力平衡結(jié)構(gòu)(椎間盤、纖維環(huán)等),對動力系統(tǒng)的肌肉損傷研究較少。項痹通顆粒(Xiangbitonggranule, XBTG),以經(jīng)典方為底方(葛根、桂枝、白芍、炙甘草),加用解肌止痛的羌活、威靈仙、防風、蒼術,舒筋通絡的川芎、姜黃、雞血藤,輔以益氣扶正之黃芪,沿承精髓、發(fā)展創(chuàng)新,充分體現(xiàn)中醫(yī)藥的臨床價值和社會意義。前期試驗發(fā)現(xiàn)項痹通處方在緩解頸部疼痛、改善中醫(yī)癥候及頸椎功能障礙等方面療效確切[8],但起效機制尚不清楚。研究表明,核轉(zhuǎn)錄因子活性成分p65(NF-κB p65)在炎癥性疾病的發(fā)病機制中起著關鍵作用[9],髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)是炎癥信號通路下游的經(jīng)典適配器[10]。過氧化物酶增殖激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ, PPAR-γ)屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,可競爭性抑制炎癥途徑及相關介質(zhì)生成[11],對脊柱疾病有較好的應用前景[12]。課題組打破常規(guī),選用大鼠非家兔建立頸后肌炎癥損傷模型,從PPAR-γ/NF-κB分子角度探析項痹通顆粒可能的作用機制,為中藥復方的臨床應用提供理論依據(jù)。本研究已通過廣東省第二中醫(yī)院倫理委員會審查(粵二中醫(yī)2020倫審第K6號)。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠,2月齡,體質(zhì)量(200±20)g,普通飼料喂養(yǎng),飼料和大鼠均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(粵)2018-0002。大鼠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院SPF級動物實驗室,許可證號:SYXK(粵)2020-0059。

1.2實驗試劑與儀器

項痹通顆粒(廣東一方制藥有限公司中藥配方顆粒生產(chǎn)關鍵技術重點研究室監(jiān)督、廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院中藥制劑室制成免煎顆粒,備案號:粵藥制備字Z20210055000),5 g/袋。處方組成:葛根12 g、桂枝9 g、白芍6 g、炙甘草3 g、威靈仙 3 g、羌活6 g、防風6 g、蒼術6 g、姜黃3 g、川芎6 g、雞血藤6 g、黃芪9 g。塞來昔布(Pfizer Pharmaceuticals LLC,生產(chǎn)批號:J20140072),0.2 g/粒。

TNF-α、IL-1β、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的ELISA試劑盒(貨號:MM-0180R1、MM-0047R1、MM-0068R1),均購自廣州塞拉芬生物科技公司。PPAR-γ、NF-κB p65、MyD88、β-actin Antibody(貨號:AF6284、AF5006、AF5195、AF7018),均購自江蘇親科生物研究中心有限公司。BCA蛋白定量檢測試劑盒(貨號:BL521A),購自Biosharp,RIPA裂解液(貨號:R0278)購自Sigma,脫脂奶粉(貨號:1172GR100)購自BioFroxx。

電子天平[(1/萬)BS224S、Sartorius],凍臺(JB-L5、武漢俊杰電子有限公司),高速離心機(TGL-16R、珠江黑馬),高速組織研磨儀(Tiss-24、上海凈信),酶標儀(Rayto RT-6100、Biotek),光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100、日本尼康),VE180垂直電泳槽、VE186轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能科技有限公司),電泳儀(BG-Power 600i、北京百晶生物技術有限公司),AX-II暗匣、粵華牌暗室燈(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司),XBT-1醫(yī)用X射線膠片(柯達)。

1.3動物分組、造模及干預

將大鼠按體質(zhì)量編號,采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為假手術組、模型組、塞來昔布組、項痹通顆粒低、中、高劑量組(各10只)。將大鼠稱重,用1%戊巴比妥按40 mg/kg腹腔注射,麻醉成功后俯臥固定。剔除頸后毛發(fā),觸摸C2～6棘突并在其對應表皮沿脊柱縱向標記切口位置,消毒后,手術刀銳性切開皮膚及皮下組織,彎鉗鈍性分離皮下筋膜,直至充分暴露頸后部肌肉,用12.5 cm的彎頭止血鉗鉗夾C2～6棘突旁開0.2 cm的頸后肌中段(持續(xù)鉗夾10秒、后放開間隔10秒、扣滿3扣),待鉗夾的頸后肌呈現(xiàn)暗紅色后逐層縫合皮膚,清除周圍血跡。假手術組以相同方式暴露頸后肌而不鉗夾處理。除假手術組外,對50只造模的大鼠分別于造模前、造模后第2天(干預前)進行尾靜脈采血,造模后較造模前的血清TNF-α、IL-1β、PGE2明顯升高(P<0.05),提示造模成功(見表1)。動物給藥劑量參照常用實驗動物及人的體表面積比例(劑量換算)表[13]。藥物以g/kg的劑量并以每千克體質(zhì)量10 mL生理鹽水稀釋,給藥塞來昔布、項痹通顆粒1次/天,持續(xù)1周,同時假手術組及模型組予以生理鹽水灌胃。

表1 造模前、造模后第2天(干預前)大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量比較

1.4取材

干預7天后對所有大鼠進行尾靜脈采血,離心、取上部血清注入Eppendorf 管內(nèi),-80℃冰箱保存以備ELISA檢測。取血后用過量麻醉法處死大鼠,同造模的方法暴露頸后肌,用組織剪將C2～6棘突旁開0.2 cm的頸后肌中段取下(左、右各1塊)。一塊置入裝有4%多聚甲醛的凍存管中(液體體積為組織體積的5倍),放入4℃冰箱,24小時后更換液體,連續(xù)固定48 小時,以備病理切片用;另一塊用0.9%的生理鹽水沖洗后放入凍存管,迅速置于液氮中冷凍,再放入-80℃冰箱中以備WB檢測。

1.5指標檢測與方法

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清炎癥相關因子表達 操作步驟嚴格參照ELISA試劑盒說明書,用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算出炎癥相關因子含量。

1.5.2 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察頸后肌細胞的形態(tài)學變化 依次入二甲苯、無水乙醇,水洗,再入蘇木素染液,水洗,分化,水洗,返藍,沖洗,接著入酒精脫水、伊紅染色,最后入無水乙醇、二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡采集圖像。

1.5.3 蛋白免疫印跡法(Western blot, WB)檢測PPAR-γ/NF-κB通路蛋白表達 取約50 mg組織置于研磨器內(nèi),加入250 μL RIPA裂解液進行勻漿,研磨后吸出置于1.5 mL EP管內(nèi),冰上裂解30分鐘。配平后,4℃、14000 r離心10分鐘,收集上清液,用BCA法檢測蛋白濃度。將提取好樣品的蛋白溶液和5×上樣緩沖液按4∶1混合,煮沸10分鐘,緩慢恢復至室溫。SDS-PAGE電泳,分離目標蛋白后轉(zhuǎn)膜。取出雜交膜,TBST漂洗5分鐘×1次;5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2小時,TBST洗膜8 分鐘×1次;合適的一抗稀釋濃度4℃過夜,TBST洗膜8 分鐘×3次;相應二抗稀釋液37℃孵育2 小時,TBST洗膜8分鐘×3次;添加化學熒光發(fā)光底物,放至暗盒,顯影、曝光。利用Imag J對WB條帶進行灰度分析,以β-actin為內(nèi)參計算各蛋白的相對表達量。

1.5.4 斜板試驗評價大鼠頸部運動功能 參考Rivlin[14]:將大鼠放在可調(diào)節(jié)的橡膠面斜板上,使其身體縱軸和斜板縱軸一致。逐漸升高斜板,直至大鼠能停留5秒,記錄斜板與水平面的夾角。每只大鼠測3次,取平均值。

1.6統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1模型評估

與造模前比較,造模后第2天(干預前)的大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量明顯升高(P<0.05),提示建模成功,見表1。

2.2干預7天后大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2比較 干預7天后,與假手術組比較,模型組TNF-α、IL-1β、PGE2均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,塞來昔布組和項痹通顆粒低、中、高劑量組TNF-α、IL-1β、PGE2降低(P<0.05);與塞來昔布組比較,項痹通顆粒中、高劑量組TNF-α、IL-1β降低(P<0.05),見表2。

表2 干預7天后各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2比較

2.3干預7天后大鼠頸后肌細胞的形態(tài)學變化

與假手術組比較,模型組肌細胞核減少、結(jié)構(gòu)紊亂、變形水腫、大小不一。與模型組比較,塞來昔布組和項痹通顆粒低、中、高劑量組肌細胞核稍增多、結(jié)構(gòu)變清晰、水腫程度減輕、形狀較規(guī)則,以項痹通顆粒組改善較明顯,見圖1。

2.4干預7天后大鼠頸后肌PPAR-γ、NF-κB p65、MyD88表達量比較

干預7天后,與假手術組比較,模型組NF-κB p65、MyD88升高(P<0.05);與模型組比較,塞來昔布組和項痹通顆粒低、中、高劑量組PPAR-γ升高及NF-κB p65、MyD88降低(P<0.05);與塞來昔布組比較,項痹通顆粒低、中、高劑量組PPAR-γ有所升高及NF-κB p65、MyD88有所降低(P<0.05)。見圖2、表3。

注:A 假手術組;B 模型組;C 塞來昔布組;D 項痹通顆粒低劑量組;E 項痹通顆粒中劑量組;F 項痹通顆粒高劑量組。

表3 干預7天后各組大鼠頸后肌PPAR-γ、NF-κB p65、MyD88表達量比較

2.5干預7天后大鼠頸部運動功能比較

干預7天后,與假手術組比較,模型組斜板試驗功能角度明顯減小(P<0.05);與模型組比較,塞來昔布組和項痹通顆粒低、中、高劑量組斜板試驗功能角度增大(P<0.05),見表4。

表4 干預7天后各組大鼠頸部運動功能比較

3 討論

從解剖結(jié)構(gòu)、病理特征考慮,靈長類動物是最理想的實驗對象,但體型大不易控制、不符合實驗倫理、價格昂貴等因素,未能實驗普及。目前多選用鼠、兔等動物建模,價格低廉、飼養(yǎng)方便。建立頸椎病模型,一般將兔放于固定盒中處于低頭屈曲45°,持續(xù)5小時,1次/天,連續(xù)12周[15]。此方法確實可誘發(fā)出頸椎病模型,但時程長不可控、適用范圍局限(只適合頸型頸椎病)[5,16],不能精確地誘導出實驗所需節(jié)段的模型。長期低頭位,頸后肌廣泛受損,不同兔的頸后肌同一部位的病理可能不盡相同,無法保證取樣標本皆符合標準模型要求。若將頸后肌全部取下,但實驗檢測時只需較小體積的組織,也缺乏標本一致性。低頭位導致局部組織、細胞和分子的變化只能在動物被處死后進行評估,模型隨時間變化是否會影響結(jié)果參數(shù),若對不同時間點參數(shù)進行處理,則會增加實驗兔數(shù)量和研究成本。本實驗造模頸后肌炎癥損傷,通過一次性手術直接對頸后肌中段造成創(chuàng)傷,精確地控制發(fā)病部位、發(fā)病時間及損傷程度,標本的可重復性強,避免了長時程不利因素的干擾及藥物造模對動物代謝的影響。盡管大鼠頸部結(jié)構(gòu)尺寸較兔小,難以定位,但所需設備簡單、取材步驟簡化。若能達到同樣實驗效果,即使為驗證不同時間點參數(shù)而處死動物,單從節(jié)省成本出發(fā),大鼠比兔更合適。本實驗中與造模前比較,造模后第2天(干預前)的大鼠頸后肌中段顏色暗紅,TNF-α、IL-1β、PGE2顯著升高,表明造模成功。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞中的與炎癥反應密切相關的核轉(zhuǎn)錄因子,靜息狀態(tài)下與上游NF-κB抑制蛋白(IκB) 形成三聚體。當炎癥因子的刺激信號作用于Toll樣受體4時,后者的結(jié)構(gòu)域與MyD88的同源結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,活化MyD88,引起白介素受體相關激酶磷酸化,進而與腫瘤壞死因子受體相關因子6作用并形成復合物,使NF-κB誘導激酶(NF-κB inducing kinase,NIK)活化,再激活IκB激酶(IκB kinase,IKK),進而使IκB上兩個Ser位點活化,從而IκB蛋白從三聚體中解離出來并降解,顯示出NF-κB的核定位序列,促使NF-κB p65由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核,與DNA增強子特異性位點結(jié)合,啟動基因轉(zhuǎn)錄程序,釋放和表達IL-1β、TNF-α等炎癥因子,加重炎癥損傷程度[17]。PPAR-γ是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,作為內(nèi)源性代謝物或外源性化合物的傳感器,為治療炎癥相關疾病提供新的思路和方向[18]。作為調(diào)控炎癥反應的關鍵點,活化的PPAR-γ可降低IKK活性,使結(jié)合于NF-κB的p50/p65烷基化二聚體的水平降低,直接抑制NF-κB的DNA合成[19]。項痹通處方中葛根為君藥之一,花生酸是葛根的主要活性成分。查閱數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)PPAR-γ是重要的花生酸靶蛋白[20],說明PPAR-γ可參與項痹通顆粒的藥效機制。

頸項僵痛可歸結(jié)于“項痹”“肌痹”“筋痹”等。嶺南臨海、多潮濕,氣溫偏高、人們嗜用空調(diào),風邪襲表、寒濕入侵,頸先受之,經(jīng)氣不舒,脈絡閉塞,肌肉失養(yǎng),經(jīng)筋攣急,致頸項強痛、肩背拘緊,氣血失調(diào),運行不暢,病理產(chǎn)物積聚,誘發(fā)頸后肌炎癥損傷。項痹通處方中桂枝溫經(jīng)通絡、解肌發(fā)表,葛根升陽解肌、緩解項背拘急,合為君藥以解肌舒筋、標本同治。白芍合甘草以酸甘化陰斂營、柔筋緩急,增強君藥功效。羌活入膀胱經(jīng)、解表散寒、滲濕止痛,威靈仙通行十二經(jīng)、舒筋活絡,防風辛甘微溫、祛風勝濕,蒼術辛苦溫、燥濕健脾,四者祛除病邪、治標求本。痹癥日久、氣血瘀滯、肌筋痙攣,川芎行氣開郁、活血止痛,姜黃辛溫、破血通經(jīng),雞血藤甘苦溫、補血行血,三者調(diào)暢氣血、通則不痛。黃芪益氣固表、防御外邪。藥理研究顯示,桂枝[21]、葛根[22]、白芍[23]、防風[24]、威靈仙[25]、姜黃[26]等中藥的有效成分或主要提取物從不同途徑發(fā)揮高效的抗炎鎮(zhèn)痛作用。本研究中干預7天后,與模型組比較,項痹通顆粒低、中、高劑量組TNF-α、IL-1β、PGE2均降低,提示項痹通顆粒有較好的抗炎療效。以塞來昔布為陽性對照藥物,項痹通顆粒中、高劑量組TNF-α、IL-1β降低,其抗炎作用稍勝一籌,但PGE2無顯著性差異,可能與樣本量較小或塞來昔布較強的止痛效應有關。與假手術組比較,模型組NF-κB p65、MyD88均升高,PPAR-γ無顯著性差異,提示炎癥反應增強、因配體依賴特性PPAR-γ未被激活。與模型組比較,項痹通顆粒低、中、高劑量組PPAR-γ升高,NF-κB p65、MyD88均降低,提示PPAR-γ活化、炎癥程度下降。與塞來昔布組比較,項痹通顆粒低、中、高劑量組PPAR-γ升高,NF-κB p65、MyD88降低,提示在激活PPAR-γ、減輕炎癥方面項痹通顆粒優(yōu)于塞來昔布。斜板試驗對肌力的判斷敏感性較好,多用于評價急性損傷模型[27]。本研究對象為大鼠頸后肌急性損傷,頸后肌受損,肌力減退,頸部運動功能受限。與假手術組比較,模型組斜板試驗功能角度減小,經(jīng)項痹通顆粒干預后其角度增大,提示項痹通顆?？筛纳拼笫蟮念i部運動功能障礙。

綜上,項痹通顆?？筛纳拼笫箢i后肌炎癥損傷,其起效機制可能與激活PPAR-γ途徑、抑制NF-κB通路、減少下游炎癥因子釋放有關,從而為頸椎病生物力學失衡之動力平衡系統(tǒng)受損的臨床治療提供靶點,為醫(yī)者提供優(yōu)化方案和參考價值。實驗后期將采用聚合酶鏈式反應檢測炎癥因子、通路蛋白的基因表達水平以進一步佐證實驗結(jié)論。