不同致病力松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群繁殖對(duì)溫度的響應(yīng)

應(yīng)晨希,吳小芹*,溫彤玥,張 巖

(1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,南京 210037;2. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210007)

松材線(xiàn)蟲(chóng)病是我國(guó)最具危險(xiǎn)性的森林病害。目前該病已在我國(guó)19個(gè)省(市、自治區(qū))742個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生(李碩等,2022),已對(duì)我國(guó)的松林生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的破壞,并帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。作為我國(guó)最重要的林業(yè)外來(lái)入侵有害生物,松材線(xiàn)蟲(chóng)Bursaphelenchusxylophilus在我國(guó)入侵?jǐn)U張過(guò)程中是如何適應(yīng)環(huán)境的目前并不明確。植物病害的發(fā)生通常是寄主、病原和環(huán)境三者共同作用的結(jié)果(Aikawaetal., 2006)。松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的增殖與建立成功與否是病害發(fā)生的關(guān)鍵,因此研究松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的生態(tài)適應(yīng)性顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),入侵生物對(duì)各種環(huán)境因子的適應(yīng)幅度較廣,對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的忍耐力,溫度是其中最重要的影響病害發(fā)生的環(huán)境因子之一(Wangetal., 2005)。Mamiya曾報(bào)道松材線(xiàn)蟲(chóng)在低于10℃時(shí)不能發(fā)育,在28℃以上增殖會(huì)受到抑制,在33℃以上不能繁殖;并認(rèn)為一個(gè)地區(qū)的年平均氣溫可作為該地區(qū)松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生的重要指標(biāo),如日本發(fā)病最嚴(yán)重的南部地區(qū),年平均溫度在15～17℃以上;而日本北部,年平均溫度在10～12℃以下,發(fā)病輕微(Mamiyaetal., 2004)。Gruffudd等報(bào)道歐洲地區(qū)夏季平均氣溫高于20℃時(shí)松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)提高(Gruffuddetal., 2019)。我國(guó)也有研究表明,在夏季高溫干旱時(shí),該病導(dǎo)致的松樹(shù)死亡會(huì)顯著增加,在20℃以下時(shí),松樹(shù)發(fā)病,但不枯死;在18℃以下時(shí),苗木生長(zhǎng)正常(Chengetal., 2009)。說(shuō)明溫度對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生發(fā)展影響較大。

有研究發(fā)現(xiàn),松材線(xiàn)蟲(chóng)在單異活體培養(yǎng)時(shí)繁殖力較擬松材線(xiàn)蟲(chóng)B.mucronatus強(qiáng),與致病力呈現(xiàn)正相關(guān)性(Tomminen, 1993),這與多數(shù)關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)種群增殖研究的結(jié)論相一致(Yuetal., 2012),離體培養(yǎng)時(shí)強(qiáng)毒松材線(xiàn)蟲(chóng)種群完成一代的速度比弱毒松材線(xiàn)蟲(chóng)種群和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群要快得多,較短的生活周期和更高的繁殖率意味著具有更高的種群增長(zhǎng)率(徐紅梅等, 2017)。但也有研究發(fā)現(xiàn),擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在單異活體變溫培養(yǎng)條件下,種群增長(zhǎng)較松材線(xiàn)蟲(chóng)快(王文琪, 2006; 謝立群等, 2007)。來(lái)自北歐的無(wú)致病力擬松材線(xiàn)蟲(chóng)較來(lái)自美國(guó)南部的松材線(xiàn)蟲(chóng)在低溫培養(yǎng)下有著更快的繁殖速率(Wangetal., 2005)。由此可見(jiàn),松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的種群增殖與溫度的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。且目前在已有的關(guān)于不同溫度下松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)毒力和繁殖力的研究中,多以單異活體(菌食)培養(yǎng)下種群的繁殖量與其毒力相關(guān)聯(lián);而在病害發(fā)生過(guò)程中,松材線(xiàn)蟲(chóng)在感病寄主體內(nèi)(植食)的繁殖能力應(yīng)能更準(zhǔn)確的反映種群的寄生性與致病力的關(guān)系。近年松材線(xiàn)蟲(chóng)已向我國(guó)北部地區(qū)如遼寧等省快速遞進(jìn)(鄭雅楠等, 2021)。然目前關(guān)于不同溫度環(huán)境對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)種群繁殖影響的報(bào)道仍尚少見(jiàn)。因此,本研究選取不同致病力的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株,對(duì)其在不同溫度下的單異活體培養(yǎng)和寄主體內(nèi)生存條件下的種群繁殖及其與溫度的關(guān)系進(jìn)行探討,以期解析松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在菌食和植食條件下如何響應(yīng)不同溫度而使種群繁衍的生殖對(duì)策,為揭示松材線(xiàn)蟲(chóng)的生態(tài)適應(yīng)性和入侵機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株及培養(yǎng)

供試的松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株為ZJ和YW4,擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株為15#和JNL10,均保存于江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。供試線(xiàn)蟲(chóng)的寄主和來(lái)源見(jiàn)表1。

通過(guò)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)平板在25℃無(wú)光照條件下培養(yǎng)灰葡萄孢Botrytiscinerea4～5 d,待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)PDA后接入供試線(xiàn)蟲(chóng),培養(yǎng)5～6 d,待灰葡萄孢菌絲被吃光后采用貝爾曼漏斗法收集線(xiàn)蟲(chóng)(Viglierchioetal., 1983)。將收集的線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液離心(4 000 r/min)3 min,棄上清;再用雙蒸水(double distilled H2O,ddH2O)清洗3次,4 000 r/min離心,每次3 min,備用。

1.2 供試植物

供試植物為生長(zhǎng)狀況一致的2年生健康黑松Pinusthunbergii,培養(yǎng)于南京林業(yè)大學(xué)溫室,培養(yǎng)溫度控制在28～32℃,相對(duì)濕度控制在65%～75%。

表1 供試松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的寄主和來(lái)源

1.3 供試線(xiàn)蟲(chóng)致病力的測(cè)定

將供試的4個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株制備成蟲(chóng)懸液(3 000條/mL),以皮接法對(duì)黑松盆栽苗進(jìn)行人工接種,用無(wú)菌刀片在近地約10 cm的莖干處割開(kāi)樹(shù)皮深達(dá)木質(zhì)部,用鑷子取無(wú)菌棉球塞入,每株接1 mL的蟲(chóng)懸液,以接種1 mL ddH2O的松樹(shù)作為對(duì)照,封口膜做成漏斗狀將切口及棉球包裹住,保證蟲(chóng)液不滲漏。每個(gè)處理設(shè)置8個(gè)重復(fù)。根據(jù)針葉顏色變化程度,將松樹(shù)的感病程度劃分為以下5個(gè)等級(jí):0級(jí):所有針葉均健康呈綠色;Ⅰ級(jí):小部分針葉開(kāi)始變黃;Ⅱ級(jí):一半左右的針葉變黃或萎蔫;Ⅲ級(jí):大部分針葉褐變萎蔫;Ⅳ級(jí):所有針葉失綠枯萎。在接種后的第20、40和60 d統(tǒng)計(jì)松苗的發(fā)病率和感病指數(shù),發(fā)病率和感病指數(shù)按如下公式進(jìn)行計(jì)算(方中達(dá),2007):

發(fā)病率(%)=發(fā)病株樹(shù)/總株樹(shù)×100

感病指數(shù)=Σ(各級(jí)株樹(shù)×等級(jí)數(shù))/(總株樹(shù)×發(fā)病最高等級(jí)數(shù))×100

1.4 不同溫度下單異活體培養(yǎng)的線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化率的測(cè)定

收集經(jīng)灰葡萄孢培養(yǎng)的4個(gè)供試線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株,將蟲(chóng)懸液倒入培養(yǎng)皿中,加入ddH2O靜置10 min。后將上層液輕輕倒入到另一培養(yǎng)皿中,線(xiàn)蟲(chóng)的卵會(huì)因其特有的粘性附著在原培養(yǎng)皿的底部。重復(fù)以上步驟5次,除去蟲(chóng)懸液中的卵。將只含有線(xiàn)蟲(chóng)的蟲(chóng)懸液置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h使線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)新的卵,收集線(xiàn)蟲(chóng)卵用于試驗(yàn)。

將收集到的供試線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)卵置于恒溫梯度培養(yǎng)箱(EYELA MTI-201)中,設(shè)置15、20、25、30和35℃進(jìn)行恒溫培養(yǎng),培養(yǎng)皿上層吸附潮濕的吸水紙保濕,各處理設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后于蔡司顯微鏡(Zeiss, LSM710,德國(guó))下觀(guān)察記錄線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化情況,并計(jì)算卵孵化率(初始卵的數(shù)量為60～100枚)。

1.5 單異活體培養(yǎng)的線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量與后代雌雄性比的測(cè)定

挑取各供試線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株的3條雌成蟲(chóng)和3條雄成蟲(chóng)于灰葡萄孢培養(yǎng)基上,置于恒溫梯度培養(yǎng)箱中,設(shè)置15、20、25、30和35℃進(jìn)行培養(yǎng),各處理設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)8 d后,將灰葡萄孢菌絲塊切碎,在體式顯微鏡(Zeiss, Leica MZ16,德國(guó))下測(cè)定雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)數(shù)量并計(jì)算雌雄性比。

1.6 不同溫度下寄主黑松中線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量和雌雄性比的測(cè)定

測(cè)定接種前各供試線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)懸液的雌雄性比后,將線(xiàn)蟲(chóng)接種到2年生黑松上,接種量和接種方法同1.3所述。接種后的黑松置于恒溫梯度培養(yǎng)箱內(nèi),分別設(shè)置15、20、25、30和35℃恒溫培養(yǎng),每隔3 d澆水一次。培養(yǎng)12 d后,采用貝爾曼漏斗法收集松苗中的線(xiàn)蟲(chóng),洗凈后于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量和雌雄性比。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel(Microsoft Corp.,Redmond,WA,USA)計(jì)算重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviations,SD)作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果,并使用Prism 5軟件(北京),采用Duncan多重比較法檢驗(yàn)各處理的差異顯著性,顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病力

供試松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株間的致病力存在差異(表2)。接種后20 d,感染松材線(xiàn)蟲(chóng)的黑松出現(xiàn)發(fā)病癥狀,其中接種ZJ蟲(chóng)株的發(fā)病率為75%,感病指數(shù)25;接種YW4蟲(chóng)株的發(fā)病率為50%,感病指數(shù)18。而此時(shí)接種擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的所有黑松未表現(xiàn)出感病癥狀。接種后40 d,接種松材線(xiàn)蟲(chóng)ZJ蟲(chóng)株的所有黑松均感病,感病指數(shù)69;接種松材線(xiàn)蟲(chóng)YW4蟲(chóng)株的黑松發(fā)病率為75%,感病指數(shù)34;接種擬松材線(xiàn)蟲(chóng)15#蟲(chóng)株的黑松發(fā)病率為12.5%,感病指數(shù)6.25;而接種擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的JNL10的黑松未表現(xiàn)出癥狀。接種后60 d,接種松材線(xiàn)蟲(chóng)ZJ蟲(chóng)株的所有黑松100%發(fā)病,感病指數(shù)85;接種松材線(xiàn)蟲(chóng)YW4蟲(chóng)株的黑松感病率為75%,感病指數(shù)34;接種擬松材線(xiàn)蟲(chóng)15#蟲(chóng)株的黑松感病率為12.5%,感病指數(shù)6.25;而接種擬松材線(xiàn)蟲(chóng)JNL10蟲(chóng)株的黑松仍未表現(xiàn)出癥狀。接種無(wú)菌水的黑松始終表現(xiàn)健康。可見(jiàn),供試4個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株的毒力從高到低依次為:松材線(xiàn)蟲(chóng)ZJ>松材線(xiàn)蟲(chóng)YW4>擬松材線(xiàn)蟲(chóng)15#>擬松材線(xiàn)蟲(chóng)JNL10,且擬松材線(xiàn)蟲(chóng)JNL10對(duì)黑松沒(méi)有致病力(表2)。

表2 松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)黑松致病力測(cè)定結(jié)果

2.2 不同溫度對(duì)單異活體培養(yǎng)的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化率的影響

不同致病力的松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在不同溫度下的卵孵化結(jié)果(圖1)表明:供試的4個(gè)蟲(chóng)株在5個(gè)溫度梯度下的孵化率均表現(xiàn)為正態(tài)分布的格局。在15℃各個(gè)蟲(chóng)株均有少量幼蟲(chóng)孵化出;且隨著溫度的升高,孵化率逐漸增高,25℃時(shí)孵化率達(dá)到最大值,之后隨著溫度升高,孵化率有所下降。孵化率最高的是松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ,在5個(gè)溫度下均高于其他蟲(chóng)株;在25℃時(shí),其孵化率為73.3%,是各處理中最高的。其次是無(wú)毒的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)JNL10,在20℃和25℃時(shí)的孵化率都僅次于ZJ蟲(chóng)株。4個(gè)蟲(chóng)株中孵化率最低的為松材線(xiàn)蟲(chóng)弱致病力蟲(chóng)株YW4,在15℃時(shí)其孵化率僅為11.4%,是各處理中最低的,在20℃和25℃,其孵化率也低于其他3個(gè)蟲(chóng)株。說(shuō)明在單異活體培養(yǎng)條件下,供試的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)卵的孵化率與致病力并無(wú)明顯相關(guān)性。

圖1 不同溫度對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株卵孵化率的影響Fig.1 Effects of diferent temperatures on the egg hatching rate of Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus

2.3 不同溫度下單異活體培養(yǎng)的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群繁殖量的變化

供試蟲(chóng)株在灰葡萄孢上不同溫度下的繁殖量(8 d)測(cè)定表明,松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在15℃下僅有極少量的2齡幼蟲(chóng),說(shuō)明在15℃時(shí),線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育受到抑制,無(wú)法正常生長(zhǎng)。而在20、25、30和35℃下,各處理都有較多的雌雄成蟲(chóng)產(chǎn)生。供試的4個(gè)蟲(chóng)株在20℃時(shí)繁殖量較低;在25℃時(shí),繁殖量較大幅度的提升,其中具致病力的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)15#蟲(chóng)株增加最多,達(dá)到初始蟲(chóng)量的16倍左右。4個(gè)蟲(chóng)株出現(xiàn)最大繁殖量的溫度梯度有所不同,其中擬松材線(xiàn)蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株15#和無(wú)毒蟲(chóng)株JNL10的最大繁殖量出現(xiàn)在25℃,松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ的最大繁殖量出現(xiàn)在35℃,而松材線(xiàn)蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株YW4出現(xiàn)在30℃,且高于30℃時(shí)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ的繁殖量。觀(guān)察同時(shí)發(fā)現(xiàn),在25～35℃時(shí)松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株的繁殖量間以及擬松材線(xiàn)蟲(chóng)具毒力蟲(chóng)株的繁殖量間無(wú)顯著差異(圖2)。由此可見(jiàn),供試的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株在菌食條件下有著各自最適的生長(zhǎng)溫度;松材線(xiàn)蟲(chóng)的弱毒蟲(chóng)株和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)同樣可耐受高溫;且致病力強(qiáng)的蟲(chóng)株并未表現(xiàn)出高的繁殖能力。

2.4 不同溫度對(duì)單異活體培養(yǎng)的線(xiàn)蟲(chóng)種群雌雄性比的影響

觀(guān)察發(fā)現(xiàn),在灰葡萄孢培養(yǎng)條件下,除15℃外,松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)后代中雌成蟲(chóng)數(shù)量都多于雄成蟲(chóng),大部分處理的雌雄性比比值都大于2.0,最小的性比也達(dá)到1.85。20℃時(shí)各個(gè)蟲(chóng)株都有著相對(duì)于其它溫度下最高的性比,其中擬松材線(xiàn)蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株15#的性比為2.66,為各個(gè)處理中最大的。而隨著溫度的升高,各蟲(chóng)株性比不斷下降,后代雌成蟲(chóng)在種群中的比例逐漸降低,雄成蟲(chóng)的數(shù)量則相應(yīng)增加。20℃和25℃時(shí),擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的性比均高于松材線(xiàn)蟲(chóng);30℃和35℃時(shí),松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的性比差別不大(除30℃時(shí),擬松材線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)毒蟲(chóng)株JNL10的性比高于其他蟲(chóng)株)(表3)。

圖2 不同溫度下在灰葡萄孢上培養(yǎng)的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖量Fig.2 Reproductive capacity of Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus cultivated on Botrytis cinerea at different temperatures注:A,松材線(xiàn)蟲(chóng);B,擬松材線(xiàn)蟲(chóng)。下圖同。Note: A, Bursaphelenchus xylophilus; B, Bursaphelenchus mucronatus. The same below.

表3 不同溫度下單異活體培養(yǎng)的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)后代的性比變化

2.5 寄主黑松中松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群在不同溫度下的繁殖量變化

松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)接種黑松12 d后的繁殖量測(cè)定表明:松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)致病力蟲(chóng)株ZJ較弱致病力蟲(chóng)株YW4和其它2個(gè)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株表現(xiàn)出很高的繁殖力;在15℃下,松材線(xiàn)蟲(chóng)在寄主黑松中繁殖量約為500條,擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在寄主黑松中繁殖量約為280條,均大大高于它們?cè)诨移咸焰呱系姆敝沉?隨著溫度的上升,強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ的繁殖量不斷增加,在30℃的黑松中達(dá)到了最高,較初始蟲(chóng)量增長(zhǎng)了5倍;在35℃時(shí)其繁殖量有所下降,但還是保持在較高的水平。松材線(xiàn)蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株YW4在25℃有著最高的繁殖量,且在各個(gè)溫度下,YW4蟲(chóng)株的繁殖量均低于強(qiáng)致病力的松材線(xiàn)蟲(chóng)ZJ蟲(chóng)株。擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在黑松體內(nèi)的繁殖力明顯低于松材線(xiàn)蟲(chóng),且也低于其在灰葡萄孢上的繁殖力;其中繁殖量最低的為無(wú)致病力的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)JNL10,在25℃時(shí)最大繁殖量為452條,較初始蟲(chóng)量只增長(zhǎng)1倍左右;擬松材線(xiàn)蟲(chóng)有毒蟲(chóng)株15#的繁殖量隨溫度增高有所增加,但在20℃至35℃時(shí)無(wú)顯著性差異。表明低致病力和無(wú)致病力的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株在黑松體內(nèi)并不具有種群繁殖優(yōu)勢(shì);在寄主體內(nèi),不同溫度條件下的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖力與其致病性存在正相關(guān)的關(guān)系,即在寄主松樹(shù)中,致病力越強(qiáng)的蟲(chóng)株,其繁殖力越大。結(jié)果同時(shí)表明,4個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株在35℃時(shí)的繁殖量都出現(xiàn)一定的下降,說(shuō)明高溫對(duì)種群的增殖有一定的抑制作用(圖3)。

圖3 不同溫度下黑松體內(nèi)松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖量Fig.3 Reproductive capacity of Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus in Pinus thunbergii at different temperatures

2.6 不同溫度對(duì)寄主黑松中松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群性比的影響

松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)4個(gè)種群的初始性比為2.2～2.4,接種黑松12 d后發(fā)現(xiàn),各線(xiàn)蟲(chóng)種群的性比較接種前都有較大程度的下降(表4)。與單異活體培養(yǎng)下較高的性比不同,在黑松體內(nèi)各個(gè)蟲(chóng)株的種群性比都低于1.5。其中松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株ZJ和YW4種群在15～35℃下大多處理的性比均低于1.0,出現(xiàn)了雄成蟲(chóng)數(shù)量多于雌成蟲(chóng)的情況;相對(duì)于供試的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株,松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株的性比處于較低值。從各溫度處理來(lái)看,在寄主松樹(shù)中松材線(xiàn)蟲(chóng)不同毒力蟲(chóng)株的性比在20～30℃較大些,但總體隨溫度變化的幅度不大;而擬松材線(xiàn)蟲(chóng)15#和JNL10種群的性比率則隨著溫度的升高而增大,變化趨勢(shì)明顯,均在35℃時(shí)最大,其中無(wú)致病力的JNL10種群的性比率最高達(dá)1.42。在各溫度處理下的寄主松樹(shù)中,擬松材線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)論是毒力蟲(chóng)株還是無(wú)毒蟲(chóng)株其性比均大于1.0,而其繁殖量則處于較低的水平(表4)。

表4 不同溫度下寄主松樹(shù)中松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)后代的性比變化

3 結(jié)論與討論

溫度對(duì)入侵生物的生長(zhǎng)繁殖和定殖擴(kuò)張至關(guān)重要。且在無(wú)資源因素限制的環(huán)境中,種群增長(zhǎng)率與生物世代周期、產(chǎn)卵量和雌蟲(chóng)存活率等參數(shù)密切相關(guān)(謝立群等, 2007)。溫度對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)增殖有著重要作用(張星耀等, 2003;Zhaoetal., 2007; 盛若成等, 2019;)。因此,研究影響松材線(xiàn)蟲(chóng)種群增殖的因子有助于掌握病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。本研究探討了松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的卵孵化對(duì)不同溫度的響應(yīng),表明供試蟲(chóng)株的最適卵孵化溫度均為25℃;而在15℃和35℃下,線(xiàn)蟲(chóng)卵的孵化受到抑制,孵化率降低。研究還發(fā)現(xiàn)25℃下48 h孵化出的幼蟲(chóng)大多數(shù)處于J2階段,而在35℃下孵化率雖低但已有較多J3幼蟲(chóng)出現(xiàn),由此可推測(cè),35℃下線(xiàn)蟲(chóng)生殖世代周期縮短,這與張建平等的研究結(jié)論相吻合(張建平, 2002)。供試的4個(gè)蟲(chóng)株,致病力雖有較大差異,但在單異活體培養(yǎng)下卵的孵化率與致病力并未呈現(xiàn)一致性,對(duì)溫度的適應(yīng)性也無(wú)明顯差異,在不同溫度梯度下,呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)在單異活體培養(yǎng)的菌食條件下,擬松材線(xiàn)蟲(chóng)弱毒種群的繁殖量超過(guò)松材線(xiàn)蟲(chóng),且松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)各蟲(chóng)株有著各自的最適生長(zhǎng)溫度。松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ的離體培養(yǎng)最適溫度為35℃,在供試4個(gè)蟲(chóng)株中耐熱性最高;擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的最適增長(zhǎng)溫度相對(duì)較低,繁殖量最高的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)弱毒蟲(chóng)株15#最適溫度為25℃,隨著溫度升高其繁殖量有所下降但仍保持在相對(duì)較高的水平。說(shuō)明在菌食條件下不同毒力的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖力對(duì)溫度的響應(yīng)不同,且致病力與繁殖力并未呈現(xiàn)正相關(guān)性。這與Wang等觀(guān)察到的結(jié)果有所不同(Wangetal., 2005)。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)溫度在15℃時(shí),單異活體培養(yǎng)的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的繁殖受到抑制,線(xiàn)蟲(chóng)種群表現(xiàn)出不能增長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30℃時(shí),松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株ZJ種群增長(zhǎng)較快,說(shuō)明較高溫有利于松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖。

松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)為兩性生殖線(xiàn)蟲(chóng),理論上其后代性比為1∶1。Rutherford等研究發(fā)現(xiàn)擬松材線(xiàn)蟲(chóng)單異活體培養(yǎng)時(shí)種群性比率最高為2.0,在某些重復(fù)中,性比出現(xiàn)過(guò)極端的50∶1的情況(Rutherfordetal., 1990)。本研究中,在單異活體各不同溫度培養(yǎng)時(shí),不同毒力的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的性比率多介于2.0～3.0之間。在20℃下,各個(gè)種群的性比是最高的,隨著溫度的升高性比呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì),雄蟲(chóng)在種群中所占的比例不斷提高。與此同時(shí),種群的繁殖量較20℃時(shí)也有著較大的提高。本研究對(duì)離體恒溫梯度培養(yǎng)下的線(xiàn)蟲(chóng)增殖觀(guān)察時(shí)間為8 d,若延長(zhǎng)觀(guān)察時(shí)間,通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的世代繁殖,種群的性比可能會(huì)有一定變化。

在自然條件下,松材線(xiàn)蟲(chóng)多以寄主植物薄壁細(xì)胞為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源(Matsunagaetal., 2003; Mamiyaetal., 2004)。Yamaguchi的研究表明,在25～30℃下,黑松幼苗中松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖是穩(wěn)定的,且隨著溫度的升高呈指數(shù)增長(zhǎng);但當(dāng)溫度在20℃以下不足以促進(jìn)松材線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育時(shí),松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖就可能受到宿主防御系統(tǒng)的抑制(Yamaguchietal., 2020)。本研究發(fā)現(xiàn),在寄主黑松體內(nèi)的植食條件下,在15℃下,松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的繁殖量約為500條,擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖量約為280條;隨著溫度的升高線(xiàn)蟲(chóng)種群的繁殖量上升;松材線(xiàn)蟲(chóng)多數(shù)處理的雌雄性比低于1.0,且隨溫度升高不斷微調(diào)下降;而擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的繁殖量隨溫度升高增長(zhǎng)緩慢,其性比1.0～1.5,呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。Mamiya等研究發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)在低于10℃會(huì)出現(xiàn)滯育現(xiàn)象,夏季的高溫和生長(zhǎng)季的干旱有利于松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生(Mamiyaetal., 2004)。本研究說(shuō)明松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)溫度的響應(yīng)不同,且隨溫度升高,樹(shù)體中線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖量增加。已有多項(xiàng)研究預(yù)計(jì)由于全球變暖導(dǎo)致的溫度變化將會(huì)進(jìn)一步加劇松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生和擴(kuò)展(Hirataetal., 2017; Ikegamietal., 2018; Gruffuddetal., 2019)。本研究還表明在寄主松樹(shù)中,線(xiàn)蟲(chóng)在較低溫下仍能維持一定的種群數(shù),且松材線(xiàn)蟲(chóng)的低溫適應(yīng)性高于擬松材線(xiàn)蟲(chóng),松材線(xiàn)蟲(chóng)的這種溫度適應(yīng)性有助于解釋其引起的病害在我國(guó)南北方的擴(kuò)展蔓延態(tài)勢(shì)。

本研究中各蟲(chóng)株在寄主中的繁殖量和其致病力呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。即在寄主松樹(shù)體內(nèi)松材線(xiàn)蟲(chóng)的種群繁殖力明顯高于擬松材線(xiàn)蟲(chóng),且毒力愈強(qiáng)差異愈大。高繁殖量的生物通常通過(guò)提高后代產(chǎn)量與投入能量的比值以達(dá)到提高生殖效率的目的(Mamiyaetal., 1977)。松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種群的后代性比隨生存條件變化而產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)整,這種能力可能是種群繁殖力產(chǎn)生差異的原因。在營(yíng)養(yǎng)條件充分時(shí),線(xiàn)蟲(chóng)種群中雌蟲(chóng)數(shù)量的增加可使得種群數(shù)量增長(zhǎng),但雌蟲(chóng)消耗的營(yíng)養(yǎng)隨之增多,因此在線(xiàn)蟲(chóng)種群中存在著一種“平衡”以制約雌蟲(chóng)的增長(zhǎng)。推測(cè)強(qiáng)致病力的松材線(xiàn)蟲(chóng)在遇到寄主及溫度脅迫時(shí)可通過(guò)降低種群中的雌蟲(chóng)比和增加雄蟲(chóng)比使得種群保持持續(xù)增長(zhǎng),這與其在真菌營(yíng)養(yǎng)下的菌食階段顯著不同。而擬松材線(xiàn)蟲(chóng)在寄生條件下,種群性比率保持較高,其種群數(shù)量則增長(zhǎng)緩慢。由此推斷,松材線(xiàn)蟲(chóng)種群可以通過(guò)調(diào)節(jié)雌雄蟲(chóng)在種群中所占的比例來(lái)應(yīng)對(duì)寄主和環(huán)境條件的改變,使得種群增長(zhǎng)保持在相對(duì)較高的水平而促進(jìn)病害的發(fā)生。本研究也暗示隨著營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境壓力的增加,那些能夠使性比下降、雄蟲(chóng)數(shù)量在種群中所占比例增加的種群將更具繁殖力,同時(shí)也更具致病力。