基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的作用機(jī)制

黎潔 李永平 朱港星

在急進(jìn)高原時(shí),面臨急性低氧的情況下,人體的各個(gè)系統(tǒng)會受到嚴(yán)重影響,結(jié)構(gòu)和功能也會隨之發(fā)生改變。大腦作為機(jī)體最主要的耗氧器官,在急性低氧時(shí)極容易出現(xiàn)腦功能和腦代謝的紊亂,甚至發(fā)生不可逆的腦損傷[1]。研究證實(shí),大腦急性低氧時(shí)會導(dǎo)致海馬神經(jīng)元急性死亡、神經(jīng)毒性物質(zhì)積累和神經(jīng)炎癥[2]。

從中醫(yī)辨證角度出發(fā),研究發(fā)現(xiàn)氣虛證是高原病的基本證候類型,其主要癥狀包括少氣懶言、呼吸氣短、神疲乏力,或有頭暈?zāi)垦?活動后諸證加重等[3],加之氣候寒冷,易傷人陽氣,脈中之血凝而留止,故高原病的基本病機(jī)多為氣虛血瘀[4-5]。

補(bǔ)陽還五湯是王清任在《黃帝內(nèi)經(jīng)》的指引下創(chuàng)立的針對氣虛血瘀證的名方[6],方中重用黃芪大補(bǔ)元?dú)?配當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁以活血化瘀,再加地龍疏通經(jīng)絡(luò),諸藥合用使氣足以推動血行[7]。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可以有效促進(jìn)大腦神經(jīng)元的修復(fù)[8],且數(shù)據(jù)表明補(bǔ)陽還五湯用于心腦血管疾病的防治是有效的,在臨床上得到廣泛運(yùn)用[9]。本文旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)了解補(bǔ)陽還五湯的潛在效應(yīng)成分,對其防治高原急性低氧性腦損傷的作用機(jī)制進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫與統(tǒng)計(jì)軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss ADME數(shù)據(jù)庫[10](https: //www.swissadme.ch/)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[11](https: //www.swisstargetprediction.ch/)、UniProt數(shù)據(jù)庫[12](https: //www.uniprot.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫[13](https://www.omim.org/)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫[14](https:www.genecards.org/)、Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、Cytoscape 3.7.1軟件、Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html)、微生信平臺(https://bioinformatics.com.cn/)。

1.2補(bǔ)陽還五湯的成分搜集與篩選

補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁、地龍7味中藥組成,通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集以上中藥的化學(xué)成分,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為條件獲得符合條件的化合物。由于TCMSP無法檢索到地龍的化學(xué)成分,故通過查詢文獻(xiàn)收集地龍的有效成分,獲得有效成分的CAS號,在Pubchem中輸入CAS號得到地龍有效成分的分子結(jié)構(gòu)圖,并下載分子結(jié)構(gòu)圖的SDF格式文件,最后通過Swiss ADME進(jìn)行篩選,篩選條件為胃腸道吸收(GI absorption)顯示“High”以及“Druglikeness”中的“Lipinski”“Ghose”“Veber”“Egan”“Muegge”至少滿足2個(gè)“Yes”,滿足以上條件即為地龍的有效成分。

1.3補(bǔ)陽還五湯有效成分作用靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫“Related Targets”的“Targets Information”中輸入黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁有效成分的Mol ID即可獲取作用靶點(diǎn)。保留經(jīng)Swiss ADME篩選后符合條件的地龍有效成分,通過Swiss Target Prediction進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,物種選為“Homo sapiens”,上傳地龍有效成分的SDF格式結(jié)構(gòu)圖后開始預(yù)測,將靶點(diǎn)信息導(dǎo)出,剔除probability<0的靶點(diǎn)基因后即為地龍有效成分作用靶點(diǎn)。將以上獲取的靶點(diǎn)信息通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及去重后所得即為補(bǔ)陽還五湯有效成分作用靶點(diǎn)。

1.4疾病靶點(diǎn)篩選

高原急性低氧性腦損傷屬于高山病中的一類,故尋找疾病靶點(diǎn)時(shí),使用高原低氧性腦損傷(hypobaric hypoxia brain injury, HHBI)和急性高山病(acute mountain sickness,AMS)為關(guān)鍵詞進(jìn)行查尋。在OMIM在線數(shù)據(jù)庫中依次檢索“hypobaric hypoxia brain injury”“acute mountain sickness”,點(diǎn)擊“Download As”下載“Excel File”,共得到475個(gè)疾病基因;同法在Gene Cards在線數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞后導(dǎo)出,共獲得315個(gè)疾病基因。

1.5藥物—疾病交集靶點(diǎn)的構(gòu)建

將補(bǔ)陽還五湯各成分靶點(diǎn)及急性高原低氧性腦損傷疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1中取得交集靶點(diǎn),并繪制韋恩圖。

1.6繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將1.5篩出的藥物與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫中的“Multiple proteins”,物種選擇為“Homo Sapiens”后進(jìn)行搜索,將“minimum required interaction score”設(shè)置為“medium confidence(0.400)”,構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.7“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用Cytoscape3.7.1繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,并利用內(nèi)置工具Network Analyzer分析該圖的拓?fù)鋮?shù)。

1.8GO功能及KEGG信號通路富集分析

將藥物與疾病的交集基因?qū)隡etascape在線數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)置為“H.Sapiens”,點(diǎn)擊“Custom Analysis”。參數(shù)設(shè)置為Min Overlap>3,P Value Cutoff<0.01,Min Enrichment>1.5。分別進(jìn)行GO功能富集分析,包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)及KEGG信號通路富集分析。選取BP、CC、MF中最顯著的10個(gè)條目上傳至微生信平臺,進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。KEGG中選取最顯著的20條信號通路的靶點(diǎn),應(yīng)用Sytoscape 3.7.1繪制“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,同時(shí)用微生信平臺對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1補(bǔ)陽還五湯的成分收集與篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索補(bǔ)陽還五湯的有效成分,以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件共收集到黃芪20個(gè)成分,當(dāng)歸2個(gè)成分,赤芍29個(gè)成分,川芎7個(gè)成分,紅花22個(gè)成分,桃仁23個(gè)成分,共103個(gè)成分,刪除無作用靶點(diǎn)及重復(fù)成分后最終得到62個(gè)有效成分。TCMSP無法檢索地龍的有效成分,查閱文獻(xiàn)篩出地龍64個(gè)化學(xué)成分[15-16],并查詢64個(gè)化學(xué)成分的CAS號,運(yùn)用CAS號在Pub chem數(shù)據(jù)庫中獲得每個(gè)化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)圖,經(jīng)Swiss ADME篩選出滿足條件的45個(gè)化學(xué)成分,最后運(yùn)用Swiss Target Prediction對地龍化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,有作用靶點(diǎn)的有效成分共31個(gè)。共篩得補(bǔ)陽還五湯93個(gè)有效成分,其中黃芪20個(gè),當(dāng)歸2個(gè),赤芍29個(gè),川芎7個(gè),紅花22個(gè),桃仁23個(gè),地龍31個(gè),共有成分7個(gè)。

2.2補(bǔ)陽還五湯有效成分作用靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP“Related Targets”中搜集各味中藥的有效成分作用靶點(diǎn),分別得到赤芍120個(gè),川芎31個(gè),當(dāng)歸51個(gè),紅花339個(gè),黃芪333個(gè),桃仁91個(gè);地龍有效成分經(jīng)Swiss Target Prediction預(yù)測后獲得511個(gè)作用靶點(diǎn)。補(bǔ)陽還五湯共獲取1476個(gè)作用靶點(diǎn),通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化處理及去重后共獲得344個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.3急性高原低氧性腦損傷疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在OMIM數(shù)據(jù)庫、Gene Cards數(shù)據(jù)庫檢索“hypobaric hypoxia-induced brain injury”“high-altitude sickness”的靶點(diǎn),經(jīng)過去重后共獲得718個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.4“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)的構(gòu)建

將補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)基因與急性高原低氧性腦損傷疾病靶點(diǎn)基因?qū)隫enny2.1獲取交集,共獲得63個(gè)交集靶點(diǎn)基因。見圖1。

圖1 補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的“藥物-疾病”靶點(diǎn)基因交集圖

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將63個(gè)藥物與疾病的交集基因?qū)隨tring在線數(shù)據(jù)庫,得到一個(gè)有63個(gè)節(jié)點(diǎn)、648條邊、“average node degree”為20.6的PPI蛋白互作圖。根據(jù)degree值大小排名靠前的有蛋白激酶B1(protein kinase B1,Akt1)、白介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、腫瘤蛋白P53(tumor protein p53,TP53)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、IL-1β、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)α等靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6補(bǔ)陽還五湯“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.7.1繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)圖共165個(gè)節(jié)點(diǎn),363條邊。165個(gè)節(jié)點(diǎn)中包括7個(gè)藥物節(jié)點(diǎn),86個(gè)藥物活性成分節(jié)點(diǎn),8個(gè)共同活性成分節(jié)點(diǎn),1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn),63個(gè)基因節(jié)點(diǎn),見圖3。根據(jù)節(jié)點(diǎn)degree值的大小選取前10個(gè)活性成分,見表1。

表1 “藥物—活性成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)degree值排名前10的藥物有效成分

注:藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)為補(bǔ)陽還五湯7種藥物名稱,紅色棱形節(jié)點(diǎn)為藥物共有活性成分,除紅色外的其它彩色棱形節(jié)點(diǎn)為藥物活性成分,黃色正方形節(jié)點(diǎn)為藥物、疾病共有靶點(diǎn)。

2.7GO功能及KEGG信號通路富集分析

將藥物與疾病的交集基因?qū)隡etascape在線數(shù)據(jù)庫,分別進(jìn)行GO富集分析及KEGG生物途徑分析。其中BP、CC、MF排名前10的條目如圖4所示。在BP中,對脂多糖的反應(yīng)、對氧氣水平降低的反應(yīng)、對激素的反應(yīng)等排列靠前;在CC中,膜筏、分泌顆粒腔、受體復(fù)合物、細(xì)胞器外膜等排位靠前;MF主要包括血紅素結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶結(jié)合等。

圖4 補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的BP、CC、MF通路富集圖

選取KEGG信號通路富集分析的前20個(gè)條目,篩出這20條通路的靶點(diǎn)基因,導(dǎo)入Cytoscape3.7.1繪制“通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,如圖5所示。KEGG信號通路富集分析如圖6所示,P值和關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量決定節(jié)點(diǎn)的顏色和大小,顏色由紅變黃表示P值從小到大,節(jié)點(diǎn)由小變大表示關(guān)聯(lián)基因數(shù)量從少到多。結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯治療高原急性低氧性腦損傷的機(jī)制主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/Akt信號通路、HIF-1信號通路、Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信號通路、Apelin信號通路等。

注:粉色節(jié)點(diǎn)為通路名稱,紫色節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)基因。

3 討論

補(bǔ)陽還五湯出自王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)·下卷·癱痿論》,是治療氣虛血瘀證的代表名方,現(xiàn)被廣泛運(yùn)用于心腦血管疾病的防治[17]。在急性低壓低氧時(shí),大腦容易受到氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙的影響,導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[18],海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡更為顯著,尤其是CA3區(qū)[19]。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯通過調(diào)節(jié)炎癥、抑制血小板過度活化聚集從而改善凝血功能,具有活血化瘀及抗炎等作用,可用于治療多種因素導(dǎo)致的大鼠急性血瘀證[20];還可改善血液流變學(xué),加快血流速度,增加腦血流量,改善腦的能量代謝,減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)[21-22],促進(jìn)海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖,從而誘導(dǎo)神經(jīng)再生[23]。

從圖3、表1可知,補(bǔ)陽還五湯作用于急性高原低壓低氧性腦損傷時(shí),木犀草素、楊梅酮、芒柄花黃素、山奈酚、鞣花酸、毛蕊異黃酮等有效成分具有較大節(jié)點(diǎn),這可能是補(bǔ)陽還五湯中的核心有效成分,這些成分主要通過抑制炎癥反應(yīng)、對抗氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。木犀草素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡物質(zhì),積極促進(jìn)生存信號的釋放,從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用[24]。楊梅酮可改善LTP信號通路,恢復(fù)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白,從而改善認(rèn)知功能,此作用也可能與楊梅酮維持海馬部位氧化還原狀態(tài)相關(guān)[25]。芒柄花黃素通過激活PI3K/Akt信號通路減少海馬神經(jīng)元的凋亡[26],還可以抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白信號傳導(dǎo),增強(qiáng)強(qiáng)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf-2)/血紅素加氧酶信號通路傳導(dǎo),改善認(rèn)知功能[27]。山奈酚可增強(qiáng)Nrf-2的表達(dá),從而抑制活性氧、TNF-α等炎性物質(zhì)的產(chǎn)生與釋放[28],還可抑制Toll樣受體4、NF-κB、p38蛋白激酶等因子的激活從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用[29]。鞣花酸通過調(diào)高B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/Bcl-2相關(guān)X蛋白比值減少細(xì)胞凋亡[30]。毛蕊異黃酮可增強(qiáng)Nrf2抗氧化途徑,阻斷NF-κB通路從而減少炎癥的發(fā)生[31],還可通過參與自噬和凋亡為大腦提供神經(jīng)保護(hù)[32]。到目前為止,高原急性低氧性腦損傷的主要機(jī)制主要包括神經(jīng)細(xì)胞的代謝紊亂、大腦微血管滲透性增加及氧化應(yīng)激[33],因此以上藥物化學(xué)成分對于急性高原低氧性腦損傷具有針對性作用。

根據(jù)補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷PPI網(wǎng)絡(luò)圖中degree值的大小得出藥物與疾病相互作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)有Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β、HIF-1α等,體現(xiàn)了補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。Akt1是PI3K/Akt信號通路的中心節(jié)點(diǎn),活化的Akt1磷酸化下游靶點(diǎn),調(diào)節(jié)許多生物過程,包括細(xì)胞的存活與凋亡[34]。Akt1的激活需要PI3K介導(dǎo),從而增加抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá),以應(yīng)對氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[35]。IL-6是促炎因子家族的成員,誘導(dǎo)各種負(fù)責(zé)急性炎癥的蛋白質(zhì)表達(dá),可激活B細(xì)胞分化為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞[36],亦可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[37]。研究證實(shí)IL-6經(jīng)典信號傳導(dǎo)具有抗炎和保護(hù)作用[38]。TNF控制免疫系統(tǒng)的發(fā)展、細(xì)胞生存信號通路并參與調(diào)節(jié)代謝過程[39],故調(diào)控TNF對于促進(jìn)組織穩(wěn)態(tài)和對抗炎癥至關(guān)重要[40]。動物疾病模型揭示了兩種TNF受體(TNF receptor,TNFR)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抗炎作用,研究發(fā)現(xiàn)TNFR1與炎癥變性有關(guān),TNFR2與神經(jīng)保護(hù)有關(guān)[41]。TP53既可以是自噬的激活劑,也可以是抑制劑;在缺氧的條件下,TP53通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號傳導(dǎo)促進(jìn)自噬激活,激活關(guān)鍵的自噬介質(zhì)Beclin-1[42]。VEGFA在缺氧時(shí)上調(diào),是內(nèi)皮生長因子和血管通透性的調(diào)節(jié)劑,參與細(xì)胞增殖與存活、細(xì)胞遷移等反應(yīng)[43]。HIF-1α是細(xì)胞對缺氧的主要反應(yīng)劑[44],缺氧時(shí)細(xì)胞必須依靠糖酵解產(chǎn)生三磷酸腺苷,在缺氧條件下HIF-1α可以誘導(dǎo)糖酵解酶的表達(dá)從而持續(xù)產(chǎn)生三磷酸腺苷[45]。IL-1β由多種免疫細(xì)胞類型的炎癥信號誘導(dǎo),在解決急性炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮有益作用[46]。

從KEGG信號通路富集分析來看,補(bǔ)陽還五湯作用于急性高原低氧性腦損傷主要涉及PI3K/Akt、HIF-1、JAK/STAT等信號通路。PI3K/Akt信號通路通過抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動子、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)9和叉頭框蛋白O1來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,從而減輕神經(jīng)損傷與認(rèn)知障礙[47]。PI3K/Akt磷酸化可上調(diào)線粒體轉(zhuǎn)錄因子,防止線粒體膜電位的破壞[48],激活Bcl-2,抑制caspase釋放,減少神經(jīng)元凋亡[49]。HIF-1可以緩解神經(jīng)元損傷和死亡[50],其由對氧敏感的α亞基和結(jié)構(gòu)性表達(dá)的β亞基組成[51]。其中HIF-1α是細(xì)胞對缺氧適應(yīng)反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄介質(zhì),調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)參與全身組織和細(xì)胞適應(yīng)低氧條件的基因[52],已被證實(shí)在缺氧環(huán)境和缺血性疾病中起著重要作用,其機(jī)制可能是上調(diào)IL-4、IL-10水平以及下調(diào)γ干擾素水平調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[53]。JAK/STAT信號通路涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)[54],該通路的異常激活或磷酸化與炎癥相關(guān)基因和許多神經(jīng)退行性疾病轉(zhuǎn)錄增加有關(guān),γ干擾素和IL-6是JAK/STAT通路的兩個(gè)最有效的激活劑[55],抑制JAK/STAT信號通路可以預(yù)防神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退化[56]。

綜上所述,補(bǔ)陽還五湯中木犀草素、楊梅酮、芒柄花黃素、山奈酚、鞣花酸、毛蕊異黃酮等核心有效成分通過作用于Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β、HIF1α等核心靶點(diǎn),通過參與細(xì)胞凋亡、炎癥、神經(jīng)保護(hù)等相關(guān)反應(yīng)和通路治療急性高原低氧性腦損傷,證明了補(bǔ)陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。由于補(bǔ)陽還五湯組方的復(fù)雜性、不同數(shù)據(jù)庫未實(shí)時(shí)更新等影響因素,本研究僅對補(bǔ)陽還五湯針對急性高原低氧性腦損傷機(jī)制進(jìn)行了簡單的理論預(yù)測分析,其具體的機(jī)制以及治療效果還需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。