美洲南瓜Dof基因家族鑒定與表達模式分析

孫守如　胡德菊　常靜依　王永　馬長生　朱磊

摘? ? 要：DNA結(jié)合單鋅指（DNA binding with one finger，Dof）是植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、抗逆和品質(zhì)等生命活動過程。為了鑒定美洲南瓜Dof基因家族成員和探究其表達模式，從全基因組水平篩選和分析了美洲南瓜CpDof家族成員、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序和親緣關(guān)系等，同時，通過轉(zhuǎn)錄組和熒光定量技術(shù)比較了不同成員在美洲南瓜中的時空表達與果實發(fā)育表達特性。結(jié)果表明，在美洲南瓜中存在58個Dof基因并廣泛分布于全基因組；功能域Motif 1存在于所有的Dof基因中；其啟動子序列中含有光響應(yīng)、激素響應(yīng)和防御應(yīng)激等順式作用元件；Dof基因在美洲南瓜中具有組織表達特異性和時空表達特異性?；谵D(zhuǎn)錄組和熒光定量驗證結(jié)果，表明CpDof7、CpDof30和CpDof42等基因與美洲南瓜356和296果實發(fā)育密切相關(guān)。以上結(jié)果為進一步克隆和解析南瓜屬Dof基因功能提供了有力支撐。

關(guān)鍵詞：美洲南瓜；DNA結(jié)合單鋅指；基因家族；熒光定量PCR；果實發(fā)育

中圖分類號：S642.6 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）05-016-13

Identification and expression pattern analysis of Dof gene family in? Cucurbita pepo

SUN Shouru HU Deju CHANG Jingyi WANG Yong MA Changsheng ZHU Lei

（1. Henan Cucumber Crop Planting Innovation and Utilization Engineering Technology Research Center， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan International Joint Laboratory of Horticultural Plant Biology/Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： DNA binding with one finger（Dof）is a transcription factor unique to plants， mainly involved in regulating plant life processes， such as growth and development， stress resistance， and quality. In order to identify the members of the Dof gene family and explore its expression pattern analysis in pumpkin （Cucurbita pepo）， this study screened and analyzed the members， gene structure， protein conservative motifs and genetic relationships of CpDof family from the whole genome， and compared the spatiotemporal expression and fruit development expression characteristics of different members through transcriptome and fluorescence quantitative techniques. The results showed that there were 58 Dof genes and widely distributed all over the different chromosomes; The functional domain Motif 1 exists in all Dof genes; The promoter sequence contains cis acting elements such as light response， hormone response， and defense against stress; Dof gene has tissue expression specificity and spatiotemporal expression specificity in Cucurbita pepo. Based on the results of transcriptome and fluorescence quantitative verification， CpDof7， CpDof30 and CpDof42 genes are closely related to the fruit development of pumpkin 356 and 296. This provides strong support for further cloning and analysis of the Dof gene function in Cucurbita species.

Key words： Cucurbita pepo; DNA binding with one finger; Gene family; Fluorescence quantitative PCR; Fruit development

美洲南瓜（Cucurbita pepo）是葫蘆科南瓜屬重要栽培種之一，原產(chǎn)于北美洲南部，并廣泛分布于世界各地[1]。美洲南瓜于19世紀(jì)中葉由歐洲引入中國，并在南北方廣泛栽培[2]。近些年來，隨著中國設(shè)施栽培的迅速發(fā)展，美洲南瓜的種植面積逐漸擴大，目前是僅次于黃瓜的早春茬瓜類蔬菜[3]。美洲南瓜種植技術(shù)簡單，適合集約化栽培與管理，且易獲得高產(chǎn)，因此，研究和利用美洲南瓜可以為我國園藝產(chǎn)業(yè)的多樣性和種業(yè)發(fā)展提供保障。

DNA結(jié)合單鋅指（DNA binding with one finger，Dof）家族是植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其DNA富含一個獨特的單鋅指結(jié)構(gòu)域，所以它也被稱為Dof基因家族[4]。Dof蛋白的兩個主要功能性結(jié)構(gòu)域是N端的DNA結(jié)合域和C端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[5]，N端是由52個高度保守的氨基酸殘基組成C2-C2型單鋅指結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)中還有4個保守的Cys殘基和1個Zn2+共價結(jié)合[6]。C端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域氨基酸序列多變，保守性較低，進而導(dǎo)致了Dof蛋白的功能具有多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，如果鋅指結(jié)構(gòu)中的Cys殘基或Zn2+離子發(fā)生改變，均會導(dǎo)致Dof蛋白喪失活性[7]。

Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、產(chǎn)量和抗性等方面均具有調(diào)控作用，是重要的明星轉(zhuǎn)錄因子之一。1993年，玉米的ZmDof1基因是第一個被鑒定到的Dof家族成員，它的主要功能是參與調(diào)控C4植物的光合作用[8]。目前Dof基因家族已經(jīng)在擬南芥[9]、大豆[10]、白菜[11]、番茄[12]和黃瓜[13]等多個物種中被鑒定出來。Dof蛋白的功能具有多樣性，主要涉及到植物的種子萌發(fā)、開花調(diào)控、非生物脅迫和生長發(fā)育等。如在擬南芥中，鑒定出來CDF1（Cycling Dof Factor1）和CDF2等多個Dof基因通過抑制CO（CONSTANS）基因表達來調(diào)控開花期[14-17]；在擬南芥突變體dag1（Dof Affecting Germingation1）的種子中，發(fā)現(xiàn)和赤霉素合成相關(guān)的基因表達量顯著上調(diào)，進一步推測該基因通過抑制赤霉素的生物合成來調(diào)控種子的萌發(fā)[18]。Dof家族成員還參與了植物對多種非生物脅迫的響應(yīng)，擬南芥的AtDof5.8基因與ANAC069啟動子的AAAG序列特異結(jié)合，響應(yīng)高鹽、干旱和ABA脅迫[19]；在擬南芥中，過表達番茄的SlCDF1或SlCDF3基因，都可以提高植株的耐干旱性和耐鹽脅迫性[20]。Dof蛋白也參與了植物的多種生長發(fā)育過程，過表達的OsDof12水稻株系在長日照條件下開花期顯著提前[21-22]，并且過表達OsDof12轉(zhuǎn)基因株系不僅減少水稻主支和側(cè)支的數(shù)目，降低植株高度，還使水稻的葉片變短、小穗長度變小，說明OsDof12參與水稻株型的建成[23]。并且有研究表明，水稻的OsDof3基因能夠影響種子糊粉層中赤霉素響應(yīng)的相關(guān)基因來參與調(diào)控種子萌發(fā)[24]，OsDof24和OsDof25則能夠調(diào)節(jié)水稻種子中貯藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的表達[25]。在大豆中，過表達GmDof11顯著增加了轉(zhuǎn)基因植株的分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)和百粒質(zhì)量，并提高了種子含油量及大豆的產(chǎn)量[26-27]。以上研究結(jié)果為篩選和鑒定美洲南瓜Dof基因家族及其相關(guān)研究提供了重要思路。

美洲南瓜是重要的瓜類蔬菜作物之一，在世界各地廣泛栽培，深受消費者喜愛，在瓜果蔬菜生產(chǎn)中也占有重要的地位。Dof基因家族在植物生長發(fā)育的各個方面和對逆境的響應(yīng)過程中都有參與。然而，目前在美洲南瓜中還未有任何與Dof基因相關(guān)的研究與報道。因此，筆者以美洲南瓜為研究材料，從全基因組水平鑒定和篩選了美洲南瓜Dof基因家族成員，還分析了其在染色體上的位置、蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進化關(guān)系等信息，同時利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重點篩選了果實發(fā)育相關(guān)基因，并利用實時熒光定量技術(shù)進行了驗證，為進一步研究美洲南瓜Dof基因家族的功能提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 美洲南瓜Dof基因家族成員的篩選與鑒定

從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.cucurbitgenomics.org/organism/14）中根據(jù)Dof基因家族的功能域，初步篩選獲得了美洲南瓜的全部Dof候選基因，同時利用擬南芥的Dof成員進行了基因組數(shù)據(jù)庫的同源比對分析和篩選。然后，利用在線網(wǎng)站NCBI的CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對候選Dof蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域進行驗證，將下載的文件放在軟件Tbtools中進行可視化處理，剔除重復(fù)冗余及不含Dof結(jié)構(gòu)域的不完整序列，最終獲得美洲南瓜Dof基因家族的全部候選基因，并根據(jù)其在染色體上的位置依次命名。通過Tbtools軟件中的Show Genes on Chromosome和Advanced Circos插件對Dof基因進行染色體位置和共線性的可視化分析與繪圖。

1.2 基因的結(jié)構(gòu)和保守基序分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

依據(jù)美洲南瓜Dof基因家族成員的mRNA全長序列、CDS序列、氨基酸序列、外顯子數(shù)量等基本數(shù)據(jù)，利用軟件Tbtools中的“Protein Paramter Calc”插件分析該基因家族蛋白的理論等電點、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)和疏水性等理化性質(zhì)；利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析基因家族成員的保守基序，其中參數(shù)設(shè)置如下：保守基序數(shù)量為15個，motif的長度為6～50 aa，最后將motif分析后的數(shù)據(jù)進行可視化處理[28]。

將葫蘆科作物美洲南瓜、西瓜、甜瓜和黃瓜（http：//www.cucurbitgenomics.org/）中的Dof蛋白質(zhì)序列進行同源比對分析，并利用軟件MEGA7中的最大似然法（maximum likehood，ML）構(gòu)建葫蘆科Dof蛋白的系統(tǒng)進化樹，最后利用iTOL（https：//itol.embl.de/）對構(gòu)建的進化樹進行美化與調(diào)整。

1.3 啟動子順式作用元件分析

從美洲南瓜基因組數(shù)據(jù)庫中截取Dof基因家族每個成員的啟動子序列（ATG上游2000 bp的序列），導(dǎo)入文本并整理成FAST文件，將該文件提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進行啟動子順式作用元件分析。根據(jù)分析結(jié)果，對其進行篩選排序，并利用Tbtools中的“Simple Bio Sequence Viewer”模塊進行可視化處理與分析。

1.4 基于轉(zhuǎn)錄組的美洲南瓜Dof家族成員的表達分析

根據(jù)Aliki Xanthopoulou等[29]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，調(diào)取Dof基因家族在美洲南瓜雌花、雄花、根、莖、種子等不同組織和授粉后不同時間（day after pollination，DAP）果實Dof的FKAM值。將提取的數(shù)據(jù)按照組織表達和果實發(fā)育時期表達進行分類，并利用軟件Tbtools的“Heat Map”模塊繪制Dof基因的表達熱圖，按照藍色、黃色和紅色對不同表達倍數(shù)進行賦值，其中，深藍色代表表達量較低，而深紅色代表表達量較高。

1.5 美洲南瓜幼果Dof基因的實時熒光定量（qRT-PCR）表達驗證

美洲南瓜材料引自中國國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺—蔬菜種質(zhì)資源子平臺，296和356自2018年經(jīng)過多代自交均培育至高代自交系，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜類課題組保存，試驗于2023年2—3月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類課題組實驗室進行。

以 296和356為材料，采用隨機區(qū)組法對授粉10 d后的幼果進行取樣，每個樣品3次重復(fù)，收集約0.5 g 的果肉用于后續(xù) RNA 提取。樣品經(jīng)液氮研磨成粉末后，使用Quick RNA isolation Kit試劑盒（北京，華越洋）進行總RNA的提取。第一鏈cDNA采用MonScriptTM RTIII All-in-One Mix with dsDNase試劑盒（蘇州，莫納）合成。內(nèi)參基因Cpe-action由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類課題組提供，利用Bio-Rad CFX96 TouchTM儀器進行實時熒光定量PCR檢測。

20.0 μL Real-time PCR體系如下：1.6 μL cDNA模板，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1）（表1），10.0 μL Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（南京，諾唯贊）和7.6 μL ddH2O。PCR程序為：95 ℃ 180 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。每個樣品3次重復(fù)。采用Office 2010 Excel對定量結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，并利用SPSS 22.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲南瓜Dof基因家族成員的鑒定及其理化性質(zhì)分析

經(jīng)過功能域分析和同源比對分析，初步篩選獲得61個候選Dof基因。根據(jù)它們的保守結(jié)構(gòu)域、基因完整性和相似性等進行剔除，最終在全基因組共鑒定到58個美洲南瓜Dof基因。通過全基因組信息的比對和分析，結(jié)果顯示，除LG06、LG12和LG15外，其他染色體上均有CpDof基因家族成員的分布，這說明Dof基因家族成員在美洲南瓜全基因組上的分布較為廣泛，且有可能在全基因組發(fā)揮作用。根據(jù)它們在染色體上的位置，依次命名為CpDof1～CpDof58（圖1）；其中，10號染色體分布的Dof家族基因最多，共7個；LG07、LG11和LG17染色體上僅檢測到1個Dof基因。從圖2可以看出，大部分美洲南瓜Dof基因在不同染色體上均具有較高的共線相關(guān)性，而LG06、LG12、LG15和LG17未檢測到。其中，LG17上的CpDof44是全基因組唯一一個與其他染色體無任何共線性關(guān)系的Dof基因。

為了明確美洲南瓜58個Dof蛋白的理化性質(zhì)，對其分子質(zhì)量、等電點和親水性等進行了計算和分析（表 2）。結(jié)果表明，美洲南瓜Dof蛋白的氨基酸數(shù)目為108～490 aa，分子質(zhì)量介于12.31～53.80 kD之間，最小和最大值分別對應(yīng)的是CpDof26和CpDof18；其等電點介于5.28～9.93之間，其中共有14個蛋白的等電點小于7，為酸性蛋白，43個蛋白的等電點大于7，為堿性蛋白；僅有1個為中性蛋白，對應(yīng)的是CpDof25；不穩(wěn)定系數(shù)為38.06～72.29，除CpDof33、CpDof51和CpDof52這3個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，剩余55個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明大部分CpDof為不穩(wěn)定蛋白；其脂肪系數(shù)為36.67～66.39，最小值和最大值分別對應(yīng)CpDof15和CpDof48；該家族成員蛋白的親水系數(shù)均為負(fù)數(shù)，介于-0.960～-0.226之間，表明58個Dof蛋白均屬于疏水性蛋白。

2.2 美洲南瓜Dof家族成員的進化樹構(gòu)建

為了解美洲南瓜Dof基因與其他葫蘆科作物Dof基因的同源性，構(gòu)建了包含美洲南瓜（Cp）、西瓜（Cl）、甜瓜（Cm）和黃瓜（Cs）4個物種的Dof蛋白質(zhì)序列進化樹（圖3）。參考葫蘆科其他物種的分組方式，將其劃分為A到I共9個亞群。其中，A亞群含有的Dof蛋白數(shù)量最多，為33個；C亞群含有的CpDof蛋白最多，為12個，占比41.38%；I亞群含有Dof蛋白數(shù)量最少，共5個蛋白，其中有2個是CpDof蛋白，占比為40.00%。相較于其他瓜類，美洲南瓜的CpDof在9個亞群中均含有多個成員。

2.3 美洲南瓜Dof基因家族保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)聚類和進化樹構(gòu)建結(jié)果（圖4-a），對美洲南瓜不同亞群Dof家族成員的功能域和基因結(jié)構(gòu)進行了分析。結(jié)果表明，CpDof蛋白序列中共發(fā)現(xiàn)15個保守基序（圖4-b）。58個CpDof家族成員中均包含Motif 1（代表Dof結(jié)構(gòu)域），因此，Motif 1為核心保守結(jié)構(gòu)域。保守基序在蛋白/基因的功能中起著重要作用，它也是基因分類和功能分化的基礎(chǔ)；進化樹中屬于同一亞群的保守基序的類型、數(shù)量和分布結(jié)構(gòu)類似，表明亞群內(nèi)的CpDof親緣關(guān)系更相近。如圖所示，Motif 3為C亞家族所有成員特有的基序，Motif 5為F亞家族所有成員特有的基序，由此可見，同一亞群內(nèi)的成員可能在瓜類作物中有著相似的功能。

對其基因結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，在B、C、D和F亞家族中，多數(shù)CpDof基因含有2個外顯子；在A、E、G、H和I亞家族中，多數(shù)CpDof基因只包含有CDS而無UTR（圖4-c）。每個亞家族的基因結(jié)構(gòu)大部分相似，但是同一亞家族中也出現(xiàn)少數(shù)成員的結(jié)構(gòu)差異，表現(xiàn)為內(nèi)含子與外顯子的數(shù)量和長度不等。例如，D亞家族CpDof49和CpDof56內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量與其他成員明顯不同。另外，F(xiàn)亞家族的基因總堿基數(shù)相對較大（圖4-c），G亞家族則較小，這說明Dof家族的不同成員在進化中存在序列的分化。

2.4 美洲南瓜Dof家族成員的啟動子順式調(diào)控元件

為了深入了解CpDof家族成員的結(jié)構(gòu)和功能，對CpDof的啟動子進行了順式調(diào)控元件的分析（圖5）。結(jié)果顯示，大部分啟動子區(qū)域均含有光響應(yīng)元件，還有參與低溫、傷口、防御和應(yīng)激等多種脅迫響應(yīng)的順式調(diào)控元件，這說明該家族的啟動子具有與脅迫相關(guān)的調(diào)控功能；同時也包含了參與水楊酸、脫落酸以及茉莉酸甲酯（MeJA）反應(yīng)的順式作用元件等。其中，CpDof4、CpDof35和CpDof46的啟動子區(qū)域均含有多個脫落酸相關(guān)的順式作用元件。

2.5 美洲南瓜Dof基因家族的表達模式分析

為了解CpDof基因家族成員的生物學(xué)功能和表達特性，利用Aliki Xanthopoulou在2021年已公布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了美洲南瓜CpDof基因在雌花、雄花、根、莖、種子等不同組織中的表達情況（圖6）。結(jié)果表明，部分Dof基因如CpDof9、CpDof10、CpDof14和CpDof23等8個基因在所有的美洲南瓜組織中的表達量都比較低。其次，CpDof基因具有組織表達特異性，如在雄花中CpDof5、CpDof26和CpDof43基因的表達量明顯高于雌花和其他組織；在葉柄中表達量較高的基因有CpDof42和CpDof47；在種子中CpDof40和CpDof41的表達量較高；在主根和側(cè)根中表達量高的均集中在CpDof1、CpDof13、CpDof19等基因上。此外，部分CpDof在美洲南瓜的葉片中具有特異性表達，如CpDof39、CpDof42、CpDof54等在美洲南瓜嫩葉中的表達量高，但在老葉中的表達量顯著下調(diào)；CpDof7、CpDof32和CpDof46等基因在嫩葉中表達量低，在老葉中的表達量明顯上調(diào)，它們可能與葉片的衰老發(fā)育機制相關(guān)。

嫩瓜是美洲南瓜的重要產(chǎn)品器官，因此，重點分析了CpDof在開花授粉后2～30 DAP果實中的特異表達情況（圖7）：在幼果時期（2～7 DAP），CpDof31、CpDof36、CpDof49和CpDof52基因表達量相對較高，而CpDof28、CpDof45和CpDof46基因表達量相對較低。其中，CpDof16、CpDof19、CpDof26和CpDof45基因在果實發(fā)育前期（2～20 DAP）的表達量較低，但在果實發(fā)育后期（30 DAP）的表達量卻明顯上調(diào)；以上結(jié)果為進一步篩選和分析果實發(fā)育相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

2.6 Dof基因在美洲南瓜幼果中表達特征分析

在轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，對授粉后10 d的美洲南瓜高代自交系296和356幼果進行取樣，通過qRT-PCR技術(shù)分析了8個Dof基因在美洲南瓜果實中的表達情況。如圖8所示，CpDof27、CpDof30和CpDof42的相對表達量較高，而CpDof1、CpDof7、CpDof25、CpDof41和CpDof56等5個基因相對表達量較低。其中，相對表達量最低和最高的分別是CpDof7和CpDof42。CpDof7和CpDof30在2個不同美洲南瓜果實中的表達量差異顯著，CpDof7在296中的表達量顯著高于356，而基因CpDof30的表達卻相反。推測這2個Dof基因可能與美洲南瓜果實的差異發(fā)育相關(guān)。自交系材料的測定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比較（圖7），8個基因的表達模式基本吻合。

3 討論與結(jié)論

筆者從美洲南瓜的基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定到58個CpDof家族成員，該家族的成員數(shù)量與煙草相近[30]。葫蘆科作物中西瓜、甜瓜和黃瓜的Dof家族成員分別為36個、34個和36個[13，31-32]，而美洲南瓜的CpDof成員數(shù)約為其他葫蘆科物種的2倍，這可能與南瓜屬特有的全基因組染色體加倍事件有關(guān)。在美洲南瓜基因結(jié)構(gòu)分析中，其家族成員間內(nèi)含子和外顯子差異較大，外顯子數(shù)量在1～3之間。有46%的CpDof沒有內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)相對簡單；這與擬南芥、水稻、小麥和黃瓜等植物的研究結(jié)果相類似[13，33-35]，表明Dof基因家族的結(jié)構(gòu)相對保守。同一亞群內(nèi)大多數(shù)成員的保守基序分布模式相似，而筆者發(fā)現(xiàn)CpDof同一亞群成員的保守基序類型、數(shù)量和順序高度相似。其中，特征功能域Motif 1存在于所有美洲南瓜CpDof中，這與擬南芥和水稻的研究結(jié)果相吻合[33]。美洲南瓜CpDof基因結(jié)構(gòu)的分析將有助于更好地鑒定和分類研究其功能?；虻膯幼訁^(qū)域響應(yīng)元件分析是預(yù)測其功能的重要手段。通過對CpDof序列上游2000 bp的啟動子區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)它們可能在激素響應(yīng)和生長發(fā)育等方面發(fā)揮作用，其中，光響應(yīng)元件是典型特征元件之一。前人研究表明，在擬南芥中，過表達Dof蛋白OBP3株系，通過改變其對光響應(yīng)進而影響擬南芥的生長[36]；擬南芥的Dof轉(zhuǎn)錄因子COG1通過光敏色素A（PhyA）和光敏色素B（PhyB）負(fù)調(diào)控光敏信號[5]。由此說明，Dof家族內(nèi)的成員可能與光調(diào)控元件有密切關(guān)系。此外，Dof還通過參與多種激素途徑，從而協(xié)同調(diào)控植物的生長發(fā)育，如煙草中Dof轉(zhuǎn)錄因子NtBBF1（rolb domain B factor 1）通過結(jié)合到基因rolB啟動子的ACTTTA區(qū)域來調(diào)控rolB基因的組織特異性表達和生長素誘導(dǎo)表達[37]，從而促進根的生長[38]。通過啟動子順式元件的分析將為進一步研究CpDof參與光信號和激素相關(guān)途徑的潛在功能奠定基礎(chǔ)。

通過對前人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進一步分析，發(fā)現(xiàn)CpDof基因在不同組織中的表達具有特異性，在美洲南瓜果實發(fā)育的過程中，大部分CpDof基因在不同時期的表達差異較小。通過美洲南瓜自交系材料的幼果對部分CpDof基因的表達量進行驗證，證明了該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。CpDof7和CpDof42基因的相反表達模式，分別說明它們負(fù)向和正向調(diào)控了果實的早期發(fā)育。在不同的美洲南瓜材料中，CpDof7和 CpDof30的表達量呈現(xiàn)顯著差異，推測是由種質(zhì)不同或果實發(fā)育（如果形大小和果實成分等）的差異造成的。如在獼猴桃果實中發(fā)現(xiàn)了乙烯響應(yīng)的C2H2-型鋅指蛋白AdDof3，可通過轉(zhuǎn)錄激活A(yù)dBAM3L啟動子正向調(diào)控獼猴桃果實中的淀粉含量[39]。Dof轉(zhuǎn)錄因子可以直接激活糖代謝和糖轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達，從而影響火龍果果實的糖分積累[40]。由此表明Dof對果實品質(zhì)有一定的調(diào)控作用，但具體的功能機制需進一步研究。

筆者通過對美洲南瓜基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析，在全基因組水平上篩選鑒定了58個美洲南瓜Dof家族基因（CpDof1～CpDof58）。這些家族成員不但在染色體上的分布呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象，且大部分個體成員在染色體間具有較高的相關(guān)性。美洲南瓜Dof基因的啟動子序列含有光響應(yīng)、激素響應(yīng)和防御應(yīng)激與脅迫響應(yīng)等多種順式作用元件，且同一亞族內(nèi)成員間的結(jié)構(gòu)和功能域高度相似。此外，美洲南瓜Dof家族基因的表達具有組織表達特異性和時空表達特異性，其中，CpDof7和CpDof30在自交系296和356幼果中的差異顯著。本研究結(jié)果為深入挖掘美洲南瓜Dof基因及其作用機制研究提供了理論依據(jù)。

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