基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)技術(shù)分析“北沙參-桔梗”治療放射性肺炎的機(jī)制?

馬思遙，任延毅，王雪冰

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 100042

放射性肺炎是胸部惡性腫瘤放療后的常見(jiàn)并發(fā)癥，普遍認(rèn)為，早期多種細(xì)胞因子相互作用誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及后期不可逆的纖維化形成是其主要病理過(guò)程［1-2］?！熬每确翁摗蚩妊€，口中有濁唾涎沫，脈數(shù)而虛，為肺痿之病”“痿者，萎也，如草木之枯萎不榮，為津涸而肺焦也”。中醫(yī)多將放射性肺炎歸為“肺痿”范疇。中醫(yī)認(rèn)為放射性肺炎屬本虛標(biāo)實(shí)，其發(fā)生發(fā)展的病機(jī)根本在于火熱之邪耗傷陰血，乃致治節(jié)不利，肺葉焦枯，瘀血內(nèi)阻［3］。治則多從養(yǎng)肺陰、清肺熱、利肺氣立論。北沙參味甘、苦、微寒，歸肺胃經(jīng)，養(yǎng)陰清肺，“善治一切陰虛火炎”，用于治療肺熱燥咳、久咳肺痿、津傷口渴等癥；桔梗味苦辛，性平，歸肺經(jīng)，具有利咽排膿、通利肺氣之功，為“肺病之舟楫”［4］。故“北沙參-桔梗”常作為配伍藥對(duì)出現(xiàn)于放射性肺炎的治療主方中。但由于中藥成分復(fù)雜，其作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)不明確，不利于進(jìn)一步深入研究。本研究通過(guò)“藥物-疾病-基因-靶點(diǎn)-通路”，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討中藥在分子層面的作用機(jī)制，為中藥治療放射性肺炎提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分與靶點(diǎn)基因篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）［5］是判斷口服藥物化學(xué)成分藥效活性的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，是藥物進(jìn)入血液循環(huán)的相對(duì)速率，反映藥物吸收、代謝的過(guò)程。類藥性（Drug-likeness，DL）［6］是化合物與已知藥物的相似性，DL≥0.18 的化合物被認(rèn)為有較好的類藥性。本研究選擇中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［7］按OB≥30%、DL≥0.18 的條件篩選“北沙參-桔?！钡臐撛谟行С煞旨捌鋵?duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（the human gene database，GeneCards）（http：//www.genecards.org/）［8］中輸入關(guān)鍵詞”Radiation pneumonia”，搜索已知與放射性肺炎關(guān)聯(lián)的靶基因。對(duì)篩選得到的“北沙參-桔?！卑悬c(diǎn)和放射性肺炎作用基因進(jìn)行匹配，獲得靶點(diǎn)基因（交集基因）。

1.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的描繪將中藥、有效成分、靶點(diǎn)基因、疾病數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件描繪有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中不同形狀的節(jié)點(diǎn)分別顯示中藥、有效成分、疾病及靶點(diǎn)基因，節(jié)點(diǎn)之間連線表示中藥-有效成分、有效成分-靶基因、疾病-靶基因的關(guān)聯(lián)。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interactions，PPl)分析將靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)平臺(tái)［9］，物種選擇為“Homo-sapiens”，high confidence=0.4，并隱藏游離靶點(diǎn)，繪制并下載PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)中靶基因與其他基因的連線數(shù)找出PPI 網(wǎng)絡(luò)中連接數(shù)較多的基因。度值（degree）和介數(shù)（betweenness）是判斷網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的主要參數(shù)，其數(shù)值越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.4 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）在R 語(yǔ) 言 環(huán) 境 下 安 裝“clusterprofiler”，對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 和KEGG功能富集（P≤0.05，Q≤0.05），繪制主要富集結(jié)果的柱狀圖［10］。并根據(jù)富集結(jié)果探討“北沙參-桔?！敝委煼派湫苑窝椎淖饔脵C(jī)理，進(jìn)一步研究“北沙參-桔?！敝委煼派湫苑窝椎纳飳W(xué)功能及KEGG信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 中藥-有效成分-共同靶點(diǎn)基因-疾病的網(wǎng)絡(luò)分析共得到OB≥30%、DL≥0.18 的有效成分即“北沙參-桔?！迸湮闈撛诘陌悬c(diǎn)基因15個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 北沙參-桔梗治療放射性肺炎的潛在有效成分

通過(guò)檢索GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)得到與放射性肺炎相關(guān)的基因，將中藥的作用靶點(diǎn)基因和放射性肺炎的機(jī)制基因進(jìn)行匹配，共得到124 個(gè)共同靶點(diǎn)基因（交集基因）。經(jīng)Cytoscape 軟件繪制得到“北沙參-桔?！迸湮橹?5 個(gè)化合物與124 個(gè)放射性肺炎靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)圖，圖中紅色代表藥物“北沙參-桔?！?，黃色菱形代表疾?。ǚ派湫苑窝祝?，黃色圓形代表靶點(diǎn)基因，粉色代表“北沙參-桔?！彼帉?duì)潛在有效化學(xué)成分?？梢?jiàn)，“北沙參-桔?！迸湮橹幸粋€(gè)有效成分可與多個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)?yīng)，而放射性肺炎的一個(gè)靶點(diǎn)亦可與多個(gè)化合物成分相關(guān)聯(lián)。見(jiàn)圖1。

圖1 “北沙參-桔梗”配伍干預(yù)放射性肺炎的有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 PPl 網(wǎng)絡(luò)將數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，一個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)內(nèi)圖形為基因轉(zhuǎn)錄的蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)未知的為空。兩節(jié)點(diǎn)之間不同顏色連線表示兩個(gè)基因的不同關(guān)系。PPI 網(wǎng)絡(luò)中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)連接數(shù)較多，提示這些靶點(diǎn)是“北沙參-桔?！备深A(yù)放射性肺炎的核心機(jī)制。其中Akt1 與58 個(gè)其他靶點(diǎn)相連接，是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，其次分別為IL-6（50 基因）、VEGFA（47基因）、MAPK1（45基因）等。見(jiàn)圖2—3。

圖2 “北沙參-桔梗”配伍干預(yù)放射性肺炎靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因連接數(shù)柱狀圖

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 共富集分析得到132 條P≤0.05 的生物過(guò)程。adjustP值越小，其可靠性越高，排名靠前的生物過(guò)程依次為：細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、受體調(diào)節(jié)活性（receptor regulator activity）、蛋白質(zhì)異二聚活性（protein heterodimerization activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）、支架蛋白結(jié)合（scaffold protein binding）、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合（growth factor receptor binding）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、抗氧化活性（antioxidant activity）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、BH 域綁定（BH domain binding）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serinetype endopeptidase activity）、內(nèi) 肽 酶 活 性（endopeptidase activity）。見(jiàn)圖4。

圖4 “北沙參-桔?！迸湮橹委煼派湫苑窝椎腉O富集分析

2.3.2 KEGG富集 共富集得到150條P≤0.05的信號(hào)通路，將KEGG 富集分析結(jié)果按校正P值排序，排名靠前的信號(hào)通路為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)、PI3K-Akt、HIF-1、C 型凝集素受體（Ctype lectin receptor，CLR）、松弛素（Relaxin）、Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）、p53 及NF-kappa B等。見(jiàn)圖5。

圖5 “北沙參-桔梗”配伍治療放射性肺炎的KEGG富集分析

3 討論

放射性肺炎發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，是多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與、多種信號(hào)分子相互影響、多通路調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程［11］。

本研究運(yùn)用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，得到“北沙參-桔?！敝?5 個(gè)化合物和與之相關(guān)的124 個(gè)放射性肺炎靶點(diǎn)基因，與中醫(yī)“同病異治，異病同治”理論相符。其中Akt1 與58 個(gè)靶點(diǎn)相連接，是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，IL-6、VEGFA、MAPK1 和JUN 位于網(wǎng)絡(luò)相對(duì)中心位置，被認(rèn)為是放射性肺炎的潛在重要靶點(diǎn)。通過(guò)GO 富集分析發(fā)現(xiàn)“北沙參-桔?！彼帉?duì)主要參與細(xì)胞因子活化、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程；通過(guò)KEGG富集分析得到TNF、IL-17、PI3KAkt、HIF-1、TLR、p53、NF-kappa B等信號(hào)通路。這些靶點(diǎn)及信號(hào)通路均是“北沙參-桔?！敝委煼派湫苑窝装l(fā)生生物過(guò)程的潛在靶點(diǎn)及通路，體現(xiàn)了該藥對(duì)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。

PI3K/Akt是蛋白激酶耦聯(lián)受體介導(dǎo)的經(jīng)典信號(hào)通路，Akt1是一種參與細(xì)胞代謝、增殖、上皮化生等多種生物學(xué)過(guò)程的蛋白，是PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，也是呼吸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，活化的Akt能夠通過(guò)活化下游因子，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，促進(jìn)放射性肺炎的發(fā)生［12-13］。此外PI3K/Akt信號(hào)通路能激活其下游mTOR，調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)。TNF-α是一個(gè)復(fù)合功能的細(xì)胞因子，可介導(dǎo)其他炎癥因子表達(dá)，與TNFR2結(jié)合可激活PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路，增加炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)［14-15］，并能刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)程。TP53可調(diào)控細(xì)胞凋亡，抑制NF-κB通路活化，負(fù)調(diào)控TNF-α等炎癥因子分泌［16］。VEGF 主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)VEGF具有促進(jìn)肺間質(zhì)內(nèi)分泌性膠原合成的作用，在肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用［17-18］。IL-6 能促使?jié){細(xì)胞分泌抗體，刺激C反應(yīng)蛋白合成，參與早期炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 大量表達(dá)與PI3K/Akt 通路被激活有關(guān)［19-20］。MAPK信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，可通過(guò)介導(dǎo)SAPK/JNK 通路產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子生成［21］。

北沙參為傘形科植物，其主要生物活性成分包括香豆素類、黃酮及酚酸類等，本研究中篩選出的香豆素類化合物包括別異歐前胡素（Alloisoimperatorin）、前胡內(nèi)酯（Ammidin）、異歐前胡素（isoimperatorin）、佛手素（Bergapten）；黃酮及酚酸類包括槲皮素（Bergapten）；甾體類包括豆甾醇（Stigmasterol）［22-23］。多項(xiàng)研究證實(shí)北沙參中分離到的別異歐前胡素、異歐前胡素、佛手素及異歐前胡素口服給藥代謝物歐前胡素等香豆素類化合物具有明確的祛痰鎮(zhèn)咳、抗炎平喘及消除自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)并提高免疫功能等作用［24-25］。黃酮類化合物槲皮素可通過(guò)下調(diào)小鼠肺組織SAPK/JNK表達(dá)，阻斷MAPK 通路活化，減少IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子釋放，抑制大鼠肺泡細(xì)胞凋亡，降低小鼠肺組織炎癥反應(yīng)程度，對(duì)肺損傷有保護(hù)作用。同時(shí)槲皮素的抗氧化作用可降低纖連蛋白表達(dá)，緩解肺組織上皮纖維化［26-27］。有研究發(fā)現(xiàn)，北沙參中分離出的豆甾醇具有抗炎活性［28］。2-O-甲基-3-Oβ-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯（Dimethyl-2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A）和2-O-甲基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯（2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A）是桔梗中分離出的桔梗酸A，是桔梗主要的皂苷元，能抑制肺細(xì)胞中IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)［29-30］。桔梗中提取出的木犀草素能通過(guò)抑制NF-κB 蛋白表達(dá)，抑制IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β等炎癥細(xì)胞因子水平及趨化因子，從而起抗炎等活性作用［31］。

1 項(xiàng)以小鼠為研究對(duì)象的藥理實(shí)驗(yàn)表明，北沙參具有鎮(zhèn)咳、祛痰作用，能夠延遲癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，緩解癥狀嚴(yán)重程度［32］。亓潤(rùn)智等［3、33］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放射性肺炎大鼠通過(guò)沙參桔梗湯干預(yù)后其支氣管上皮細(xì)胞變性程度減輕，肺組織上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷緩解，血管內(nèi)皮通透性降低，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺間質(zhì)滲出減少，同時(shí)沙參桔梗湯能降低IL-6 因子表達(dá)，療效與劑量濃度呈正相關(guān)。楊玉瑩等［34］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沙參桔梗湯可降低炎癥因子表達(dá)，且療效與劑量相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)與本研究結(jié)果相符，為“北沙參-桔?！蓖ㄟ^(guò)影響IL-6 表達(dá)、VEGFA 靶點(diǎn)、抑制PI3K/Akt-Akt1 信號(hào)通路治療放射性肺炎提供了組織病理學(xué)證據(jù)。TLR 是一種跨細(xì)胞膜免疫受體蛋白，其中TLR4 能激活NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子釋放。范瀅［35］研究發(fā)現(xiàn)，桔梗提取物可能通過(guò)抑制TLR4 信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，減少促炎細(xì)胞因子釋放，同時(shí)通過(guò)抑制NLRP3 信號(hào)通路，阻斷IL-6、IL-17等炎癥因子的產(chǎn)生來(lái)改善肺纖維化所致炎癥反應(yīng)。另有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，桔梗皂苷可通過(guò)下調(diào)IL-6、TNF-α和NF-κB 蛋白表達(dá)，抑制小鼠肺組織中炎癥浸潤(rùn)和自由基生成，減輕氣道重塑［27-28，36］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，沙參中的異歐前胡素對(duì)大鼠成纖維樣細(xì)胞的增殖抑制作用，可減少TNF-α炎癥因子表達(dá)［37］。王麗芹［38］研究發(fā)現(xiàn)以沙參為代表的養(yǎng)陰藥可通過(guò)抑制VEGF-mRNA 表達(dá)改善大鼠血管內(nèi)皮通透性，維持血管穩(wěn)態(tài)，減輕大鼠肺纖維化進(jìn)程。李瑩瑩［39］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)桔梗干預(yù)后肺組織的VEGFmRNA、TNF-α表達(dá)得到抑制，血管重構(gòu)減少，通透性降低，肺泡斷裂、融合、結(jié)構(gòu)破壞及肺纖維化程度減輕。姚嵐等［40-41］研究發(fā)現(xiàn)北沙參可下調(diào)博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1及TNF-α蛋白表達(dá)，降低肺纖維化大鼠血清中纖連蛋白和層連蛋白含量，抑制成纖維細(xì)胞因子活化，維持肺泡和毛細(xì)血管基膜結(jié)構(gòu)和功能完整，不僅在放射性肺炎早期減緩損傷發(fā)生，也對(duì)肺纖維化全過(guò)程有抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果與現(xiàn)代藥物、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，驗(yàn)證了“北沙參-桔?！彼帉?duì)治療放射性肺炎是多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，其機(jī)制可能與抑制TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，抑制PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路及MAPK通路有關(guān)。