不同產(chǎn)地葛根微乳提取物對鏈脲佐菌素2 型糖尿病小鼠的降血糖作用探討?

田紅艷，許蕊蕊

1 北京市懷柔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 101400； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

葛根（Puerariae lobatae radix）為豆科蝶形花亞科葛屬野葛或甘葛地下塊根，有悠久的藥食兩用記錄，首次記載于漢代《本草經(jīng)》［1］，于2000年被國際衛(wèi)生組織列入“藥食兩用”名錄。葛根味甘辛，性平，歸脾胃經(jīng)，有生津止渴、清火排毒作用［2-4］，其含有多種藥效明確的活性成分，其中以黃酮類和多糖為主［5］，葛根黃酮類主要活性成分是葛根素、大豆甙元等。葛根黃酮類具有改善血液循環(huán)、降血壓、抗氧化、降血糖和抗癌等作用，在糖尿病和心血管疾病及其相關(guān)并發(fā)癥等的治療中發(fā)揮良好作用［6］；葛根多糖具有抗氧化、降脂、降糖、免疫調(diào)節(jié)、解酒保肝、抑菌等多種生理功能［7］。雖然葛根黃酮類和多糖均表現(xiàn)出良好的抗氧化、降血糖等作用，但因二者水溶性的差異導(dǎo)致葛根傳統(tǒng)提取工藝存在提取率低、費時、溶劑用量大、不環(huán)保等問題。與傳統(tǒng)提取方法相比，微乳超聲提取具有明顯優(yōu)勢，這主要由于由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑組成的熱力學(xué)穩(wěn)定分散體系微乳，存在不同極性組成部位，且其液滴粒徑在10～100 nm 之間，界面大，能促進(jìn)微乳液體對各種藥材中有效成分的接觸及溶解，在提取水溶性成分的同時能更好提取脂溶性成分，對水溶性和脂溶性成分均表現(xiàn)出較高提取率［8-9］。

不同產(chǎn)地葛根臨床降血糖作用差異較大。本研究以星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化葛根的微乳提取工藝，并考察湖南、陜西、湖北、山西4 個不同產(chǎn)地葛根微乳提取液對鏈脲佐菌素2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)小鼠的降血糖作用，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器ME104E 型分析天平（上海微川精密儀器有限公司）；KH22R 型臺式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；UV-2401PC 型紫外可見分光光度儀（日本島津）；SK5200B 型低頻臺式超聲波清洗器（上海量壹科學(xué)儀器有限公司）；GA-3型血糖儀及測試試紙（三諾生物傳感有限公司）。

1.2 試藥去離子水（實驗室自制）；提取用微乳（實驗室自制）；不同產(chǎn)地葛根（購于安國藥材市場，經(jīng)北京市懷柔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院主任中藥師王金榮鑒定，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)項下要求）；無水葡萄糖對照品（純度：HPLC≥98%，批號：20190805）、蘆丁對照品（純度：HPLC≥98%，批號：20190810）、鏈脲佐菌素（純度：HPLC≥98%，批號：20190723）、二甲雙胍（純度：HPLC≥98%，批號：20190811）及 生 理 鹽 水（純 度：0.9%，批 號：20190820）均由上海源葉生物科技有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多糖含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 于50 mL容量瓶中精密稱取11.05 mg 無水葡萄糖對照品，加水溶解、定容得濃度為0.221 mg/mL 的葡萄糖對照品母液。用移液管分別精密移取該母液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL 于不同的25 mL 容量瓶中，分別加水至2 mL，按照苯酚-硫酸法處理，于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得：Y=0.03587X+0.04214，r=0.9991，在0.884～11.492 μg/mL 范圍內(nèi)葡萄糖濃度X與吸光度Y具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 供試品溶液制備 精密量取一定量葛根微乳提取液，與150 mL乙醇混勻，于4 ℃放置12 h后，離心半徑10 cm，4000 r/min，離心10 min，移棄上清液，沉淀移至50 mL容量瓶加水溶解。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 于50 mL 容量瓶中精密稱取蘆丁對照品12.02 mg，甲醇溶解定容得濃度為0.2404 mg/mL的蘆丁對照品母液。分別精密吸取該母液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL置于不同的25 mL容量瓶中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法處理，于250 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得：Y=6.0468X-0.0154，r=0.9992，在4.808～43.272 mg/mL 范圍內(nèi)蘆丁濃度X與吸光度Y具有良好線性關(guān)系。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取葛根微乳提取液適量，加入甲醇破乳、定容到10 mL。

2.3 提取物得率[10]根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品中葛根多糖和葛根總黃酮的吸光度，根據(jù)下列公式計算葛根總多糖提取率或葛根總黃酮提取率。

式中：C 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的多糖濃度/黃酮濃度（g/mL）；V 為樣品溶液的定容體積（mL）；D為葛根總多糖/總黃酮的稀釋倍數(shù)；m 為葛根原料質(zhì)量（g）。

2.4 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選微乳提取工藝

2.4.1 單因素考察 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，影響葛根總黃酮和總多糖提取率的主要因素有溶劑物料比、超聲提取時間和超聲提取功率。溶劑物料比采用4、6、8 倍3 個水平，超聲提取時間采用40、60、80 min 3 個水平，超聲功率采用400、500、600 W 3個水平，以總黃酮和總多糖為指標(biāo)，分別考察它們對提取效果的影響。結(jié)果顯示，溶劑物料比達(dá)到6 倍時總多糖提取率增加減緩，總黃酮提取率有下降趨勢，所以溶劑物料比選擇4～8倍；當(dāng)超聲時間超過70 min時，總黃酮和總多糖提取率均不再增加，因而提取超聲時間選擇40～80 min；當(dāng)超聲功率為550 W 時，總黃酮提取率最高，而后不再增加，所以超聲功率選擇400～600 W。

2.4.2 星點實驗設(shè)計 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［11］和單因素實驗結(jié)果，選取湖北葛根作為優(yōu)選微乳提取工藝原料，將溶劑物料比A、提取時間B、提取功率C 3 個因素設(shè)為自變量，以總多糖提取率（%）和總黃酮提取率（%）為評價指標(biāo)，得綜合評分。根據(jù)星點設(shè)計原理，設(shè)計3 因素3 水平實驗，水平代碼及其代表的實驗參數(shù)見表1，星點設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 設(shè)計實驗因素與水平

表2 CCD響應(yīng)面法優(yōu)選微乳提取工藝實驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.3 結(jié)果分析 運用Design-Expert.V8.0.6軟件將表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方程擬合分析，P＜0.0001，表示模型成立。方程為Y=9.58+0.24A+0.19B+0.17C+0.075AB+0.13AC+0.05BC-0.35A2-0.3B2-0.7C2，R2=0.9332，同時繪制不同溶劑物料比、提取時間和提取功率不同組合的效應(yīng)面曲線和3D圖?？梢姡味囗検交貧w模型擬合程度及可信度高，可以進(jìn)行微乳提取葛根總黃酮和總多糖工藝的預(yù)測。對葛根總黃酮和總多糖提取率Y 影響較大的是溶劑物料比A，葛根總黃酮和總多糖提取率隨溶劑物料比的增加而降低，其次是提取時間和提取功率對葛根總黃酮和總多糖也有影響。見表3圖1。

圖1 不同溶劑物料比、提取時間和提取功率不同組合的效用面曲線和3D圖

表3 葛根總多糖和總黃酮提取率二次多項式回歸模型的方差分析

經(jīng)過計算分析，綜合葛根總黃酮和總多糖含量測定等結(jié)果，微乳提取的最佳工藝條件為：溶劑物料比6.84 倍，提取時間67.79 min，提取功率517.45 W。考慮實際情況微乳提取的最佳工藝條件定為：溶劑物料比6.8 倍，提取時間68 min，提取功率520 W。

2.5 驗證試驗按照“2.4”項下微乳制備和微乳超聲提取的最優(yōu)工藝平行制備3 份湖北葛根微乳提取物進(jìn)行驗證試驗，與葛根總黃酮和總多糖提取率預(yù)測值4.98%和8.78%相比，驗證試驗葛根總黃酮平均提取率為4.40%，RSD 為0.11%；葛根總多糖提取率為8.50%，RSD 為0.12%，表明篩選的微乳超聲提取工藝條件穩(wěn)定可行。

2.6 不同產(chǎn)地葛根微乳提取的多糖和黃酮提取率測定根據(jù)“2.4”項下優(yōu)化的微乳提取工藝，提取湖南、陜西、湖北、山西4 個不同產(chǎn)地葛根微乳中葛根總黃酮和葛根總多糖，根據(jù)“2.3”項下提取率計算公式，計算各產(chǎn)地葛根總多糖和總黃酮的提取率，結(jié)果顯示湖北地區(qū)葛根總多糖和總黃酮提取率最高，多糖為8.50%，總黃酮為4.40%。見表4。

表4 不同產(chǎn)地葛根總黃酮和總多糖提取率 %

2.7 不同產(chǎn)地葛根微乳提取物對鏈脲佐菌素T2DM小鼠血糖的影響[12]

2.7.1 造模 SPF 級ICR 小鼠購買于北京斯貝福實驗動物有限公司，雄性，5周齡，體質(zhì)量（20±2）g，實驗動物合格證號：SCXK9（京）2019-0003，實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境：SPF 級動物房，自由飲水，相對濕度：40%～70%，室溫：20～26 ℃。實驗由北京市懷柔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院實驗動物倫理審查委員會審查通過。取上述SPF 級ICR 雄性小鼠70 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組10 只，模型組60只。造模前所有小鼠禁食12 h，模型組小鼠腹腔注射2 mL 的STZ（60 mg/kg），正常對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射5 天，造模期間小鼠自由飲食。于第5 天注射完STZ 后取小鼠尾部靜脈血滴于血糖測定試紙，再將試紙插入血糖儀，測定小鼠非空腹血糖，若血糖值大于16.5 mmol/L 認(rèn)為造模成功［13］。STZ 溶液配制完成后需在30 min內(nèi)完成所有小鼠注射。

2.7.2 動物分組與給藥 保留正常對照組10 只小鼠，將造模成功的60只小鼠隨機(jī)分為模型對照組、二甲雙胍組及湖南、陜西、湖北、山西葛根組各10只。根據(jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)，二甲雙胍組小鼠以200 mg/（kg·d）灌胃給藥，將二甲雙胍配制成1 mg/mL 液體，不同產(chǎn)地葛根組將微乳提取液濃縮后按小鼠體質(zhì)量每次0.5 mL/10 g 灌胃給藥（日給藥量相當(dāng)于成年人日用量的15 g 葛根原藥材），模型對照組灌胃等量生理鹽水，所有小鼠每天灌胃4 次，連續(xù)14天，所有灌胃操作時間固定。

2.7.3 檢測指標(biāo) 1）一般情況：觀察記錄小鼠外觀、精神狀態(tài)和大小便等情況；2）血糖：給藥第0、4、8、14 天檢測小鼠血糖；3）體質(zhì)量：實驗第1、2、4、6、8、10、12、14 天記錄小鼠體質(zhì)量；4）進(jìn)食量：建模成功前1 天，建模成功后第2、4、6、8、10、12、14 天灌胃給藥前，稱量每組小鼠所剩飼料重量，并補(bǔ)足等量飼料。每只小鼠進(jìn)食量=（前一天補(bǔ)足后飼料重量-當(dāng)天補(bǔ)足飼料前重量）/每籠小鼠數(shù)。

2.7.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SAS 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7.5 結(jié)果

2.7.5.1 一般狀況 模型對照組小鼠精神萎靡，尿量增加，毛豎立無光澤，其余各組小鼠外觀正常，精神和大小便正常。

2.7.5.2 血糖 正常對照組小鼠非空腹血糖平均值為7.54 mmol/L，模型對照組小鼠腹腔注射STZ 結(jié)束后小鼠非空腹血糖值高于21.2 mmol/L，高于正常對照組（P＜0.01），說明造模成功。各組小鼠連續(xù)給藥15 天，正常對照組小鼠血糖平均值為7.21 mmol/L，模型對照組小鼠血糖平均值為28.87 mmol/L，與給藥第0 天相比增加了13.88%。與模型對照組比較，二甲雙胍組和不同產(chǎn)地葛根組小鼠血糖值呈現(xiàn)不同程度下降趨勢，不同產(chǎn)地中湖北地區(qū)葛根微乳提取物組小鼠血糖值下降最顯著（P＜0.01）。表明T2DM 小鼠在不接受任何治療的情況下，血糖升高，而湖北葛根組可在一定程度上緩解小鼠糖尿病癥狀。見圖2。

圖2 不同產(chǎn)地葛根微乳提取物對小鼠非空腹血糖值的影響

2.7.5.3 小鼠進(jìn)食量 各組小鼠進(jìn)食量逐漸增加，與正常對照組小鼠相比，模型對照組小鼠進(jìn)食量增加（P＜0.01）。與模型對照組比較，除湖南葛根組外，山西、湖北、陜西葛根組及二甲雙胍組有降低進(jìn)食量作用趨勢（P＜0.05）。其中湖北葛根組降低進(jìn)食量的效果最顯著，故不同產(chǎn)地微乳超聲提取的葛根可在一定程度上緩解糖尿病相關(guān)癥狀，其中湖北葛根組控制小鼠進(jìn)食量效果最好。見圖3。

圖3 不同產(chǎn)地葛根微乳提取物對小鼠進(jìn)食量的影響

2.7.5.4 體質(zhì)量 正常對照組小鼠體質(zhì)量與實驗時間成正比，實驗結(jié)束時正常對照組小鼠體質(zhì)量較實驗前增加2.7%（P＜0.05）。其余6 組小鼠在實驗第6 天左右體質(zhì)量最大，之后隨著實驗的進(jìn)行，小鼠體質(zhì)量開始下降。實驗結(jié)束時，模型對照組小鼠體質(zhì)量為正常對照組的68.24%（P＜0.01）。二甲雙胍組及湖南、山西、湖北、陜西葛根組均能不同程度緩解糖尿病小鼠體質(zhì)量的降低，但是不同葛根組對小鼠體質(zhì)量降低的緩解能力較二甲雙胍組差，其中湖北葛根組緩解體質(zhì)量降低能力較其他葛根組穩(wěn)定。見圖4。

圖4 不同產(chǎn)地葛根微乳提取物對小鼠體質(zhì)量的影響

3 討論

微乳提取葛根，可以同時提取葛根中的多糖類成分和黃酮類成分。微乳中的表面活性劑和助表面活性劑成分可以不同程度提高體系的乳化程度，可以穩(wěn)定水介質(zhì)中的油相液滴。微乳液作為具有低粘度的光學(xué)透明體，與常規(guī)制劑相比，微乳液具有良好的穩(wěn)定性、易制性、兩親性等優(yōu)點。本研究依據(jù)微乳特點，通過微乳高效率提取葛根總黃酮和總多糖，符合環(huán)保、高效、安全需求。

T2DM 形成的最主要因素是飲食熱量高，運動較少及年齡增加，在造模第5 天，小鼠非空腹血糖上升且大于20 mmol/L，表明糖尿病小鼠模型建造成功。糖尿病患者具有多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減少的特點。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬“消渴病”范圍，而葛根具有“生津止渴”作用，用于治療“消渴病”歷史悠久［14-15］。袁媛等［16］研究表明，葛根中的葛根素對糖尿病小鼠有降血糖作用，可改善口服糖耐量，抑制糖化血紅蛋白，抑制體內(nèi)外晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成。臨床使用中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地葛根降血糖作用不同。本實驗結(jié)果顯示不同產(chǎn)地葛根提取物能在一定程度上降低血糖，以湖北地區(qū)產(chǎn)葛根最顯著，為臨床使用葛根提供參考依據(jù)。