基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析柴胡配伍香附治療癲癇的作用機(jī)制?

呂婷婷，藍(lán)紹航，李瑞暖，秦紅玲，刁麗梅△

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530000； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

癲癇是以腦神經(jīng)元異常放電為特征的慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征［1］。目前全球約有7千萬(wàn)癲癇患者，我國(guó)癲癇患病率約為3.6‰～7.0‰，活動(dòng)性癲癇患者數(shù)量達(dá)900 多萬(wàn)，而且每年以40 萬(wàn)的數(shù)量遞增［2］。癲癇反復(fù)發(fā)作，治療時(shí)間長(zhǎng)，不僅給患者身體、心理帶來(lái)傷害，也給患者家庭增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給社會(huì)、國(guó)家追求國(guó)民健康的目標(biāo)帶來(lái)了更大挑戰(zhàn)［3］。因此，研究癲癇的有效治療方法成為目前亟需解決的醫(yī)學(xué)和社會(huì)任務(wù)。

柴胡歸肝、膽經(jīng)，善于疏肝解郁；香附歸肝、脾、三焦經(jīng)，善于理氣疏肝，香附能助柴胡解肝經(jīng)之郁滯，促進(jìn)柴胡行氣活血之效。柴胡、香附常用于治療癲癇，但兩者的化學(xué)成分較多，而且兩者治療癲癇的分子機(jī)制尚不明確，因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析柴胡配伍香附治療癲癇的潛在作用機(jī)制，為后期研發(fā)及治療癲癇提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 柴胡、香附有效成分及作用靶點(diǎn)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是獨(dú)特的中草藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)，其由在《中華人民共和國(guó)藥典》中注冊(cè)的499 味中草藥組成，包含29384 個(gè)成分、3311 個(gè)靶標(biāo)和837種相關(guān)疾病，是針對(duì)每個(gè)化合物成分提供較為全面的人體吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過(guò)程的評(píng)估數(shù)據(jù)，通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)可獲取藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//Tcmspw.com/tcmsp.php）檢索“柴胡、香附”，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）表示口服劑量未改變藥物到達(dá)體循環(huán)的百分比，藥物相似性（drug-likeness，DL）是藥物設(shè)計(jì)中使用的一個(gè)定性概念，用于評(píng)估化合物的“藥物樣”程度，這有助于優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)和藥物特性，因而設(shè)置滿足條件：OB＞30%，DL＞0.18，下載符合條件的有效成分，同時(shí)查找有效成分靶點(diǎn)，將無(wú)ADME信息的化合物從最終名單中刪除。最后通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.pharmgb.org/）將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 疾病相關(guān)基因篩選人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（the human gene database，GeneCards）是人類(lèi)基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，可提供簡(jiǎn)明基因組、蛋白質(zhì)組、遺傳和功能方面已知和預(yù)測(cè)的人類(lèi)基因。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Genecards.org/）、在線孟德?tīng)柸祟?lèi)遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//www.OMIM.org/）篩選“seizure disorder”基因，以獲得相對(duì)完善的基因數(shù)據(jù)。

1.3 篩選靶基因使用R語(yǔ)言軟件“VennDiagram”包，將癲癇相關(guān)基因分別與柴胡、香附作用靶點(diǎn)取交集，獲得柴胡、香附作用于癲癇的靶基因，并繪制韋恩圖。

1.4 中藥有效成分與靶基因的關(guān)系通過(guò)自編程的Perl 腳本選出與靶基因相關(guān)的有效成分，同時(shí)利用Cytoscape 軟件構(gòu)建柴胡、香附有效成分與癲癇靶基因關(guān)系圖。

1.5 關(guān)鍵基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(proteinprotein interactions，PPl)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)可以檢索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，為了更好體現(xiàn)靶基因表達(dá)蛋白間的關(guān)系，通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)在滿足綜合得分≥0.4的條件下建立PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）采用GO 和途徑富集分析靶基因，可揭示其所參與的細(xì)胞成分、分子功能、生物過(guò)程及信號(hào)通路，便于理解中藥有效成分作用于疾病的潛在機(jī)制。Bioconductor 是一個(gè)基于R語(yǔ)言的、面向基因組信息分析的應(yīng)用軟件集合，可運(yùn)用于DNA 微陣列或基因芯片數(shù)據(jù)處理、分析、注釋等。利用Bioconductor 中的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”3 個(gè)功能對(duì)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG富集分析，GO分析包括生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)。

2 結(jié)果

2.1 柴胡、香附有效成分及其作用靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出柴胡有效成分179個(gè)，作用靶點(diǎn)1704 個(gè)，香附有效成分104 個(gè)，作用靶點(diǎn)689個(gè)，通過(guò)自編程的Perl 腳本將作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為基因文本，獲得柴胡677 個(gè)有效、獨(dú)立的靶基因，香附289個(gè)有效、獨(dú)立的靶基因。

2.2 疾病相關(guān)基因與靶基因共獲得10293個(gè)與癲癇相關(guān)、獨(dú)立有效的基因。利用R 語(yǔ)言軟件“VennDiagram”包將10293 個(gè)與癲癇相關(guān)的基因分別與677個(gè)柴胡作用靶點(diǎn)、289個(gè)香附作用靶點(diǎn)取交集，共獲得39 個(gè)靶基因，即為柴胡配伍香附治療癲癇的靶基因，見(jiàn)表1及圖1。

圖1 癲癇與柴胡、香附作用靶點(diǎn)的交集

表1 靶基因的重要通路

2.3 有效成分與靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖有效成分-靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。

圖2 柴胡-香附的“成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型

2.4 靶基因PPl網(wǎng)絡(luò)共篩選出ESR1、AR、NCOA1、NCOA2、NR3C1等30個(gè)重要靶基因，即為柴胡配伍香附治療癲癇的重要作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3—4。

圖3 柴胡配伍香附治療癲癇的靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)系較為密切的前30個(gè)靶基因

2.5 GO 和KEGG 富集分析靶基因的GO 功能主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異等；KEGG 信號(hào)通路主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、雌激素信號(hào)通路、膽堿能突觸、乳腺癌、前列腺癌，通路上CHRM2、GABRA1、PRSS1、CHRM3、CHRM1、ADRA1A、NR3C1、CHRNA2、GRIA2、ADRA2C、TRPV1、CHRM4等相關(guān)基因較為重要。見(jiàn)圖5—6。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集分析

3 討論

癲癇主要是由大腦神經(jīng)反復(fù)、過(guò)度同步化放電導(dǎo)致發(fā)作性、突然短暫性的腦功能失調(diào)、紊亂［4］，是一種毀滅性的神經(jīng)疾病，發(fā)病率、致殘率和死亡率較高［5］。目前西醫(yī)治療癲癇主要包括藥物治療、手術(shù)治療等，但存在藥物副作用大、術(shù)后復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)；中醫(yī)治療癲癇歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)獨(dú)特。本研究通過(guò)探討柴胡配伍香附治療癲癇的有效靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為中醫(yī)藥治療癲癇提供新思路。根據(jù)癲癇發(fā)作的臨床特征，將其歸于中醫(yī)“癇證”范疇，研究治療癲癇的方劑發(fā)現(xiàn)柴胡和香附配伍能夠有效治療癲癇發(fā)作。

中醫(yī)稱“癲癇”為羊癲瘋，羊角風(fēng)，最早可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》，該書(shū)提出了“胎兒病”和“癲癇”的名稱，其中《素問(wèn)?奇病論篇》載：“人生而有病癲疾者……病名為胎病此得之在母胎中時(shí)，其母有所大驚，氣上而不下，精氣并居，故令子發(fā)病發(fā)為癲疾也”，可知癲癇的發(fā)生與先天因素有關(guān)；《丹溪心法》載“無(wú)非痰涎壅塞，迷悶孔竅”，可知癇證與痰密切相關(guān)。有文獻(xiàn)認(rèn)為癲癇因痰作祟，并自擬方加減順氣導(dǎo)痰湯治療癲癇，顯示治療有效［6］。同樣也有文獻(xiàn)認(rèn)為癲癇發(fā)作常見(jiàn)痰火內(nèi)閉，使用清陽(yáng)癇速康膠囊有效率達(dá)89%［7］。

香附、柴胡配伍來(lái)源于柴胡疏肝散，出自《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》，具有疏肝理氣和活血止痛功效，主治脅肋疼痛、胸悶善太息、情志抑郁易怒、或噯氣、脘腹脹滿、脈弦。柴胡善疏肝解郁為君，香附理氣疏肝而止痛，兩者配伍可解肝經(jīng)之郁滯，共奏疏肝行氣、活血止痛之功，符合癇證病機(jī)，臨床治療癇證療效明確，但具體機(jī)制仍需更多研究挖掘。文獻(xiàn)報(bào)道柴胡加龍骨牡蠣湯加減可減少顳葉癲癇發(fā)作時(shí)間，減少發(fā)作次數(shù)，改善患者睡眠質(zhì)量［8］。陳士鐸《本草新編》中提及：香附，味苦而甘，氣寒而濃，陽(yáng)中陰也，無(wú)毒；入肝、膽之經(jīng)；專解氣郁氣疼，調(diào)經(jīng)逐瘀，皮膚瘙癢，止霍亂吐逆，崩漏下血，乳腫癰瘡；宿食能消，泄瀉能固，長(zhǎng)頭發(fā)，引血至氣分，乃氣血必用之品；香附源于莎草科植物莎草的根莖，味辛、微苦、甘，性平，能疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛［9］。

本研究共篩選出283 個(gè)候選化合物，其中柴胡179 個(gè)化學(xué)成分，香附104 個(gè)，成分-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)有204 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1184 條連接，靶基因30 個(gè)，同時(shí)通過(guò)GO 富集分析和基因KEGG 通路，篩選出GABRA1、GRIA2、TRPV1、GSK3B 4 個(gè)與癲癇相關(guān)的核心基因，篩選出5 條與癲癇相關(guān)的通路，分別為：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、雌激素信號(hào)通路、膽堿能突觸、乳腺癌、前列腺癌。

北京大學(xué)第一醫(yī)院學(xué)者通過(guò)11 例癲癇患者基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在GABRA1 基因變異相關(guān)的癲癇中，全新致病變異較遺傳變異更常見(jiàn)，由GABRA1基因變異引起的癲癇大多發(fā)生在嬰兒期，且多數(shù)患者多次癲癇發(fā)作預(yù)后較好，但仍可能存在不同程度的發(fā)育遲緩［10］。有研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)家系全基因組檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癲癇患者中GRIA2 基因c.2375G＞T（p.Gly792Val）新生錯(cuò)義變異，與神經(jīng)發(fā)育障礙伴語(yǔ)言障礙及行為異常相關(guān)［11］。研究者回顧了有關(guān)靶向TRPV1 的新型分子專利文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)抑制海馬中的TRPV1 可能是預(yù)防癲癇發(fā)作的新靶標(biāo)，最重要的是它可以作為癲癇治療未來(lái)臨床評(píng)估的候選藥物［12］。研究者使用小鼠毛果蕓香堿癲癇模型發(fā)現(xiàn)，癲癇小鼠海馬結(jié)構(gòu)中的糖原合酶激酶3β（Gsk3b）mRNA水平降低［13］。

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)去除卵巢的雌性大鼠的雌二醇對(duì)誘導(dǎo)的癲癇狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)具有保護(hù)作用［14］。研究結(jié)果表明，抗癲癇藥物可以調(diào)節(jié)海馬體中雄激素和雌激素通路，從而導(dǎo)致顳葉癲癇患者精神和生殖障礙［15］。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體1 通過(guò)改變大腦氧化或者抗氧化參數(shù)來(lái)介導(dǎo)雌激素信號(hào)通路，從而導(dǎo)致戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作和腦組織氧化損傷［16］。在癲癇活躍的人類(lèi)大腦皮層中，乙酰膽堿分解代謝酶乙酰膽堿酯酶的活性升高，也發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿合成酶膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性在癲癇患者的皮質(zhì)中被檢測(cè)到。另外也有毒蕈堿激動(dòng)劑毛果蕓香堿和檳榔堿能降低電擊誘發(fā)癲癇發(fā)作的閾值，并且乙酰膽堿酯酶抑制劑能增加嚙齒動(dòng)物對(duì)化學(xué)性驚厥的易感性［17］。乳腺癌耐藥蛋白是一種依賴三磷酸腺苷的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與癲癇和癌癥的多藥耐藥現(xiàn)象有關(guān)，是藥物相互作用的潛在來(lái)源［18］。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)柴胡配伍香附治療癲癇作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，推測(cè)其可能的作用通路，闡述柴胡配伍香附產(chǎn)生抗癲癇作用的機(jī)理。本研究發(fā)現(xiàn)柴胡配伍香附治療癲癇主要機(jī)制與雌激素信號(hào)通路、膽堿能突觸、乳腺癌3 個(gè)通路相關(guān)，但該結(jié)果尚需要后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。