白細(xì)胞介素-1β 通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲

王 棒,吳 娟,陳碩碩,程 哲,束漢生

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科,安徽 蚌埠233000)

腦膠質(zhì)瘤是起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤,是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。我國腦膠質(zhì)瘤約一半為惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)。高級別膠質(zhì)瘤由于增殖率高、腫瘤細(xì)胞高度異質(zhì)性和彌漫浸潤等特點,盡管目前采用了以手術(shù)為主,結(jié)合放化療、免疫治療、電場治療等綜合治療手段,但治療效果仍不理想,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期僅為14.4月,5年生存率約為5.5%[1-3]。目前已經(jīng)有大量的研究揭示了膠質(zhì)瘤可能的發(fā)病機制[4-5],但其確切發(fā)病機制仍不明確,因此,需要尋找膠質(zhì)瘤治療的新靶點。

腫瘤微環(huán)境中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的增加會導(dǎo)致腫瘤的顯著進(jìn)展[6]。有研究指出,膠質(zhì)瘤微環(huán)境中含有的大量的免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞等,可分泌大量的炎癥因子,比如細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、白細(xì)胞介素23(IL-23)和腫瘤壞死因子(TNF)等。這些炎癥因子可調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、侵襲等,甚至使膠質(zhì)瘤抵抗放化療[7-8]。IL-1β是一種強有力的促炎細(xì)胞因子,產(chǎn)生IL-1β的腫瘤患者一般預(yù)后較差[9]。有研究指出其在體內(nèi)外均可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[10]。IL-6亦是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子,可以直接刺激腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生成等,其在慢性炎癥、大量的造血系統(tǒng)惡性腫瘤以及實體腫瘤患者中水平均有所升高[11-12]。

之前有研究指出IL-1β可以刺激神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中核因子κB(NF-κB)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2(ERK1/2),以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)等因子的激活[13]。與此同時,IL-6/JAK2/STAT3信號通路已被證實在多種人類癌癥的生長和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[14]。因此,IL-1β能否通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展有待研究。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞極強的侵襲特性,是導(dǎo)致全切率低、術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后差的主要原因[15]。在本研究將運用多種分子生物學(xué)手段觀察不同濃度的IL-1β對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響,同時檢測IL-6的生成及JAK2、STAT3等信號分子的表達(dá)情況。重點解析在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲過程中IL-1β與IL-6的關(guān)系及其下游信號通路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

重組人IL-1β蛋白、IL-6蛋白購自蘇州novoprotein科技有限公司;重組人IL-6中和蛋白、酶標(biāo)山羊抗兔IgG單克隆抗體、Lipofectamin2000購自美國Thermo Fisher Scientific;兔抗人抗體總JAK2(t-JAK2)、Phospho-JAK2-Tyr 221(p-JAK2)、總STAT3(t-STAT3)、Phospho-STAT3-Tyr705(p-STAT3)購自武漢Abclonal生物科技有限公司;Jak2 siRNA(si Jak2)、STAT3 siRNA(siSTAT3)和對照siRNA(siNC)購自上海吉瑪科技有限公司;IL-1β、IL-6ELISA檢測試劑盒購自深圳達(dá)科為公司;CCK-8試劑盒購自合肥BIOMIKY生物科技有限公司;人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87購自武漢賽諾普科技公司,U251、A172、正常人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞株NHA由蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院惠贈;細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、減血清培養(yǎng)基Opti-MEM、胎牛血清FBS和胰蛋白酶均購自美國 Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87、U251、A172和人星形膠質(zhì)細(xì)胞 NHA均在含 10%胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基,溫度為 37℃、CO2濕度為5%的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長到70%～80%左右時進(jìn)行傳代處理。

1.2.2細(xì)胞藥物處理和分組

選擇高表達(dá)IL-1β與IL-6的膠質(zhì)瘤細(xì)胞為實驗細(xì)胞,第一階段用不同濃度的重組人IL-1β蛋白刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞的濃度分組為0、0.2 ng/ml、2 ng/ml、20 ng/ml、200 ng/ml,孵育時間24 h。后期驗證IL-1β與IL-6生成的關(guān)系分組為對照組(Ctrl)、IL-1β組(IL-1β)、IL-1β+IL-6組(IL-1β+IL-6)、IL-1β+IL-6中和蛋白組(IL-1β+Anti-IL-6),藥物濃度分別為IL-1β 20 ng/ml,IL-6 100 ng/ml,IL-6中和蛋白1000 ng/ml,孵育時間24 h。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

根據(jù)是否轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染 si-RNA的種類將每種細(xì)胞分成4組:空白對照組(IL-1β組,不轉(zhuǎn)染,僅予以IL-1β刺激)、陰性對照組(IL-1β+siNC組,轉(zhuǎn)染無意義的siNC序列),實驗組1(IL-1β+siJAK2組,轉(zhuǎn)染有意義的陽性siJAK2序列),實驗組2(IL-1β+siSTAT3組,轉(zhuǎn)染有意義的陽性siSTAT3序列)。A液:把5 μL siRNA加入到 250 μL的 opti-MEM減血清培養(yǎng)基中并搖晃混勻;B液:在 250 μL的 opti-MEM減血清培養(yǎng)基中加入5 μL Lipofectamine2000并輕輕混勻,室溫靜置 5 min;將A、B液混勻后室溫靜置18 min后將混合液分別滴加到各組,輕輕搖勻6孔板后置于恒溫孵育箱中溫育6 h,更換新鮮完全培養(yǎng)基,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后用于后續(xù)實驗。

1.2.4ELISA測IL-1β與IL-6濃度

細(xì)胞(500 000/孔)接種于6孔板,2 ml完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,用藥物刺激細(xì)胞。給藥后1天,每孔共加入100 μL樣品,每個試驗孔做3個復(fù)孔。加稀釋后的Biotinylated antibody,蓋上封板膜,孵育一定時間,洗板3次。加入稀釋后的Streptavidin-HRP,洗板3次。加入TMB孵育20～30 min顯色,顯色深藍(lán)色后加入Stop solution終止反應(yīng)。終止反應(yīng)10 min內(nèi)酶標(biāo)儀于波長450 nm處讀板。

1.2.5Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

取稀釋后的生物基質(zhì)膠 50 μL/孔勻稱地鋪于Transwell小室底層,放入培養(yǎng)箱孵育1 h待膠凝固。按組別分別取對數(shù)生長期的細(xì)胞,消化離心后用無血清不完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸計數(shù)。5萬細(xì)胞/孔加入無血清不完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)1天后,細(xì)胞予以藥物刺激或轉(zhuǎn)染siRNA。24 h后取出小室,先用4%多聚甲醛固定15 min,再用結(jié)晶紫染液染色15 min,在 PBS中漂去多余染料,小心擦凈小室上層內(nèi)細(xì)胞,在倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞形態(tài)和均勻度并計數(shù)。

1.2.6Western blot實驗檢測蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞,使用RIPA裂解細(xì)胞,BCA法總蛋白定量。配制6%分離膠和5%濃縮膠,每孔加入等質(zhì)量等體積目的蛋白(50 μg/10 μl),電壓80 V時間30 min上層濃縮膠、電壓120 V時間50 min下層分離膠電泳。轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉,采用抗GAPDH、t-Jak2、p-JAK2、t-STAT3、p-STAT3一抗及山羊抗兔IgG二抗檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)。采用Image J軟件分析條帶的光密度值,每個條帶重復(fù)3次,計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IL-1β、IL-6在膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中的表達(dá)情況及IL-1β刺激下IL-6的生成情況

ELISA結(jié)果顯示,與NHA相比,U87、U251的培養(yǎng)液中IL-1β水平明顯升高;與NHA相比,U87、U251、A172的培養(yǎng)液中IL-6水平均明顯升高(圖1A、B)。這表明某些膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有在體外自發(fā)分泌IL-1β和IL-6的能力。因此,選擇表達(dá)水平高的U87、U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 IL-1β、IL-6在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中的表達(dá)情況及IL-1β刺激下IL-6的生成情況

在U87、U251細(xì)胞中,IL-1β可以以劑量依賴性的方式促進(jìn)IL-6的生成(圖1C、D)。

2.2 IL-1β促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲

Transwell小室侵襲實驗表明,IL-1β可以以劑量依賴性的方式增強U87和U251細(xì)胞的侵襲能力(圖2)。

圖2 不同濃度的IL-1β刺激下膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的變化情況

2.3 IL-1β通過IL-6促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲

Transwell小室實驗表明,IL-6可以在IL-1β促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的情況下進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞侵襲,而IL-6中和蛋白可以顯著地抑制IL-1β的促侵襲作用(圖3)。這表明IL-1β是通過刺激IL-6的分泌來促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲的。

圖3 改變IL-6含量后U87、U251細(xì)胞侵襲能力的變化情況

2.4 IL-1β通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲

Western印跡實驗結(jié)果表明,IL-1β可以促進(jìn)JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表達(dá),IL-6可以進(jìn)一步促進(jìn)它們的表達(dá),而IL-6中和蛋白則顯著下調(diào)其表達(dá)水平。siJAK2可以下調(diào)JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)水平,而siSTAT3則不能下調(diào)JAK2磷酸化蛋白的表達(dá)水平,這驗證了JAK2和STAT3之間的上下游關(guān)系(圖4)。這表明IL-1β通過刺激IL-6的生成來促進(jìn)JAK2/STAT3通路磷酸化蛋白的表達(dá)。

圖4 不同條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)JAK2、STAT3磷酸化蛋白表達(dá)水平的變化

同時Transwell小室實驗結(jié)果表明,下調(diào)JAK2、STAT3基因表達(dá)水平可以顯著地地抑制IL-1β的促侵襲作用(圖5)。這表明JAK2/STAT3通路是IL-1β促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲所必需的。以上數(shù)據(jù)清楚地說明IL-1β是通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲的。

圖5 下調(diào)JAK2、STAT3表達(dá)水平后U87、U251細(xì)胞侵襲能力的變化情況

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是一種致命性的腦腫瘤,近年來,關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)及臨床研究有了一定進(jìn)展,但病人的預(yù)后卻沒有因此明顯改善[16-17]。分子標(biāo)記、IDH突變、MGMT啟動子甲基化、1p/19q共缺失、PTEN突變、EGFR擴增等,在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等方面發(fā)揮著核心作用,且已經(jīng)用于膠質(zhì)瘤患者的分子病理學(xué)診斷、治療選擇和預(yù)后評估,針對這些分子標(biāo)志物的許多神經(jīng)膠質(zhì)瘤療法已被用于臨床實驗,但最終成功的寥寥無幾[18],因此需要尋找新的治療靶點。

針對膠質(zhì)瘤微環(huán)境的研究是一種全新的思路。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中含有的大量的免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞等,可分泌大量的炎癥因子和外泌體等,它們可以單獨或協(xié)同調(diào)控腫瘤的生長[19]。IL-1β是一種多效性的細(xì)胞因子,是啟動免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子,同時它也是腫瘤微環(huán)境中的中心介質(zhì)[20]。有研究指出,IL-1β對于惡性細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展是必不可少的,惡性腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展與其分泌的IL-1β量密切相關(guān)[21-22]。IL-1β可由腫瘤間質(zhì)中的細(xì)胞分泌,也可由惡性腫瘤細(xì)胞分泌。各種星形膠質(zhì)細(xì)胞、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有在體內(nèi)外自發(fā)產(chǎn)生皮克級的IL-1β的能力[23]。本研究證實,在細(xì)胞培養(yǎng)液上清中,NHA及膠質(zhì)瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生微量的IL-1β,且U87、U251細(xì)胞分泌的量較NHA明顯增加,而A172細(xì)胞則變化不明顯,這可能與不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度、基因突變不同有關(guān)。

IL-1 β幾乎影響腫瘤進(jìn)展的每一步[24],白細(xì)胞介素-1β在IL-1 β惡性膠質(zhì)瘤中是一種腫瘤促進(jìn)劑[25]。本研究證實, IL-1β可以以劑量依賴性的方式促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。

IL-1β除了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的直接作用外,它還通過上調(diào)其他促炎細(xì)胞因子,包括環(huán)氧化酶2(COX-2)、IL-6、IL-8等其他細(xì)胞因子等,以及增加血管生成來推動腫瘤的生長和進(jìn)展[26]。其中IL-6已被證實是許多慢性炎癥性疾病的強力驅(qū)動,同時它在許多癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[27]。本研究證實,在細(xì)胞培養(yǎng)液上清中,NHA及膠質(zhì)瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生微量的IL-6,且膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的量均較NHA明顯增加。同時,IL-1β可以以劑量依賴性的方式促進(jìn)IL-6的生成。在給予IL-1β刺激的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)IL-6可以進(jìn)一步刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲,而IL-6中和蛋白則明顯抑制了IL-1β的促侵襲作用。這表明IL-1β是通過刺激IL-6的分泌來促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲作用的。

IL-1β介導(dǎo)的IL-6/STAT3和NF-κB這兩個關(guān)鍵炎癥信號通路的正反饋環(huán)被廣泛認(rèn)為是炎癥和癌癥之間的聯(lián)系[28]。JAK2/STA3T信號是近年來發(fā)現(xiàn)的一條與細(xì)胞因子密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程[29]。本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β可以促進(jìn)JAK2、STAT3的磷酸化蛋白的表達(dá),IL-6可以進(jìn)一步促進(jìn)它們的表達(dá)。進(jìn)一步,通過小室實驗發(fā)現(xiàn)敲低了JAK2、STAT3表達(dá)水平可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。這說明在IL-1β/IL-6刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的過程中,JAK2、STAT3的激活是必需的。與此同時,敲低JAK2明顯抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化,而敲低STAT3則對STAT3蛋白的磷酸化沒有影響,這驗證了JAK2和STAT3信號的上下游關(guān)系。以上數(shù)據(jù)表明,IL-1β是通過IL-6/JAK2/STAT3軸來促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲的。

綜上所述,本研究驗證了IL-1β在體外腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲中的作用,并發(fā)現(xiàn)IL-1β是通過刺激IL-6的分泌來促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的。同時,在暴露于IL-1β/IL-6的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲過程中, JAK2/STAT3磷酸化蛋白的激活是必需的?？傊?IL-1β通過IL-6/JAK2/STAT3軸促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用。