金汁糞菌移植對濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎小鼠疾病活動指數(shù)及炎癥反應(yīng)的影響

楊蘇琴，葛巍，張磊昌

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種多因素起源的慢性炎癥性腸病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近幾十年來，UC 發(fā)病率在我國呈上升趨勢［1］。研究表明，UC 出現(xiàn)腹痛、血性腹瀉以及腸道炎癥可能與腸道微生物群與免疫系統(tǒng)間的相互作用相關(guān)［2］，然而大多數(shù)治療UC 的藥物會干擾代謝和免疫反應(yīng)，往往會引起一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，恢復(fù)腸道微生物穩(wěn)態(tài)成為治療UC 的新策略，例如Sznurkowska 等［3］發(fā)現(xiàn)UC 患兒腸道炎癥Treg細(xì)胞比例顯著增加，采用益生菌緩解UC 取得了較好的效果［3-4］。糞菌移植（FMT）是近年開發(fā)的新治療方式，該療法將人體糞便功能菌通過口服或灌腸等方式轉(zhuǎn)移到患者胃腸道，目的在于重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)，在多項(xiàng)大型研究中均表現(xiàn)出對UC 的積極作用［5］。中藥金汁是最早應(yīng)用于FMT 療法的藥物，具有清熱解毒涼血的作用，研究表明其對腸道感染、腸道炎癥、腸易激綜合征、代謝綜合征等具有一定的臨床應(yīng)用價值［6］。本研究的目的是探究金汁FMT 對濕熱型UC 小鼠疾病活動指數(shù)以及炎癥反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級C57BL/10 小鼠，6 周齡，體質(zhì)量范圍20±2 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心提供。

1.1.2 主要藥品與試劑 葡萄糖硫酸鈉（DSS，翌圣生物科技股份有限公司），美沙拉秦腸溶片（葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19980148，規(guī)格：0.25 g），小鼠酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和造模 將49 只C57BL/10 小鼠隨機(jī)分為正常對照組和濕熱型模型組各13 只（每組隨機(jī)選取3 只進(jìn)行模型驗(yàn)證），濕熱型FMT 組和濕熱型5-ASA 組各10 只，模型驗(yàn)證組3 只。造模方法對周長琳等［7］的方法進(jìn)行了改良，除正常對照組小鼠和3 只模型驗(yàn)證小鼠外，其余小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠盒系統(tǒng)，溫度36℃，濕度80%，每天12 時給予高脂高糖飼料和2%DSS 蒸餾水溶液自由飲食；正常對照組小鼠普通環(huán)境飼養(yǎng)，給予普通飼料和飲用水；3 只模型驗(yàn)證小鼠普通環(huán)境飼養(yǎng)，給予普通飼料和2%DSS 蒸餾水溶液自由飲食。

所有小鼠連續(xù)飼養(yǎng)10 d 后進(jìn)行模型驗(yàn)證，（1）觀察小鼠一般情況，包括是否出現(xiàn)體質(zhì)量降低、膿血便、腹瀉、背毛無光澤、拱背、懶動、嗜睡、食欲不振、大便腥臭、肛周紅腫、肛溫升高等情況。（2）計算疾病活動指數(shù)（DAI），從體質(zhì)量變化、大便性狀、便血程度三個方面進(jìn)行綜合評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)量減少百分率0、1～5、6～10、11～15、大于15分別對應(yīng)0～4 分，大便性狀正常、松散、腹瀉分別對應(yīng)0、2、4 分，便血陰性、+、++、+++和大出血分別對應(yīng)0～4 分。DAI=（體質(zhì)量減少分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3。（3）正常對照組和濕熱型模型組每組隨機(jī)選取3 只和3 只模型驗(yàn)證小鼠一同進(jìn)行組織學(xué)病理觀察，HE 染色觀察結(jié)腸病理變化并進(jìn)行組織病理評分。結(jié)合以上3 點(diǎn)進(jìn)行綜合分析判斷造模是否成功。

1.2.2 藥物干預(yù)方法 以正常對照組10 只非模型驗(yàn)證小鼠作為糞菌移植供體來源，提前制備糞菌液，收集正常對照組小鼠新鮮糞便，按1∶2 比例（g/mL）溶解于無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，經(jīng)多次網(wǎng)篩過濾（10 目、20 目、32 目、50 目）所得濾液以6 000 r/min 離心15 min 獲得菌體，無菌PBS 清洗菌體3 次后，25 mL 無菌PBS 重懸菌體制成糞菌液，-4 ℃保存。

模型驗(yàn)證后開始藥物干預(yù)，各組均改為普通環(huán)境普通飼料飼養(yǎng)，正常對照組不做任何處理，濕熱型模型組予以0.2 mL 無菌PBS 灌腸，濕熱型FMT 組小鼠予以0.2 mL 糞菌液灌腸，濕熱型5-ASA 組予以美沙拉秦PBS 溶液（0.26 g/kg）灌腸。小鼠乙醚麻醉后，用預(yù)先涂抹液狀石蠟的塑膠軟管插入小鼠肛門至結(jié)腸，倒置小鼠并灌腸，灌腸后拔出塑膠管用棉簽輕壓肛門促進(jìn)閉合，小鼠保持倒置狀態(tài)60 s，2次/d，治療10 d，進(jìn)行DAI 評價后處死，沿腹正中線打開腹腔，分離結(jié)腸段并分為兩部分，分別用作組織病理檢測和細(xì)胞因子檢測。

1.2.3 療效指數(shù)計算 末次治療1 h 后計算各組小鼠療效指數(shù)，評估治療后各組小鼠DAI 得分并根據(jù)尼莫地平法計算FMT 和5-ASA 的療效指數(shù)，療效指數(shù)=（DAI 治療前-DAI 治療后）/DAI 治療前×100%。

1.2.4 HE 染色觀察病理變化 將結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛中48 h 后修整組織塊（1 cm2），常規(guī)脫水透明后采用石蠟包埋，制作3 μm 厚連續(xù)切片，用蘇木精和伊紅染色，再進(jìn)行梯度乙醇水化和透明后，用樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化并進(jìn)行組織病理評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：無炎性浸潤為0 分；輕度炎性浸潤為1 分；中度炎性浸潤，輕微出血為2 分；高度炎性浸潤，存在出血性潰瘍，結(jié)腸壁增厚，杯狀細(xì)胞減少，隱窩部分性破壞為3 分；出現(xiàn)跨壁炎性浸潤，杯狀細(xì)胞大量減少，組織大面積纖維化，隱窩大量破壞為4 分。

1.2.5 ELISA 檢測結(jié)腸組織細(xì)胞因子 將結(jié)腸組織進(jìn)行勻漿，檢測結(jié)腸組織INF-γ、IL-2、IL-4、IL-17、TGF-β、IL-10 水平，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行，設(shè)置3 復(fù)孔取平均值，最后在酶標(biāo)儀上檢測450 nm 波長吸光度并計算細(xì)胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 濕熱環(huán)境和高脂高糖飲食促進(jìn)UC 進(jìn)展

造模后，模型驗(yàn)證組和濕熱型模型組小鼠均出現(xiàn)了明顯體質(zhì)量降低、大便不成形甚至腹瀉、活動度降低、食欲不振、背毛無光澤等情況，其中濕熱型模型組小鼠有2 只有明顯膿血便、大便腥臭和肛溫升高的情況。比較3 組小鼠的結(jié)腸組織病理損傷情況，正常對照組小鼠結(jié)腸組織無明顯異常，模型驗(yàn)證組小鼠出現(xiàn)明顯炎性浸潤，以單核細(xì)胞為主，局部黏膜出現(xiàn)水腫、潰瘍、腸壁增厚和隱窩損傷，而濕熱型模型組小鼠上述表現(xiàn)進(jìn)一步加重。與正常對照組比較，模型驗(yàn)證組小鼠DAI 指數(shù)和HPS 評分均升高（P＜0.05），體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），與模型驗(yàn)證組比較，濕熱型模型組小鼠DAI 指數(shù)和組織病理評分均升高（P＜0.05），體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 小鼠結(jié)腸組織病理HE染色圖（×400）和體質(zhì)量變化（n=3）

表1 小鼠DAI指數(shù)和組織病理評分比較（）

表1 小鼠DAI指數(shù)和組織病理評分比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型驗(yàn)證組比較，bP＜0.05。

2.2 金汁FMT 減輕DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠癥狀

實(shí)驗(yàn)過程中各組均無小鼠死亡。治療期間，與正常對照組比較，濕熱型模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），DAI 指數(shù)升高（P＜0.05）；與濕熱型模型組比較，濕熱型FMT 組和濕熱型5-ASA 組小鼠體質(zhì)量呈先緩慢降低后升高趨勢（P＜0.05），DAI指數(shù)降低（P＜0.05）；濕熱型FMT 組療效指數(shù)顯著高于濕熱型5-ASA 組（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組小鼠治療期間體質(zhì)量變化情況

表2 各組小鼠DAI指數(shù)和療效指數(shù)比較（）

表2 各組小鼠DAI指數(shù)和療效指數(shù)比較（）

注：與同時間正常對照組比較，aP＜0.05；與治療前同組比較，bP＜0.05；與同時間濕熱型模型組比較，cP＜0.05。

2.3 金汁FMT 減輕DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠結(jié)腸病理損傷

治療后觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理情況。正常對照組腸壁結(jié)構(gòu)完好無異常，隱窩無破壞；濕熱型模型組炎性浸潤加重，腸壁黏膜層增厚并出現(xiàn)潰瘍出血點(diǎn)；濕熱型FMT 組和濕熱型5-ASA 組炎性浸潤有明顯改善，隱窩破壞程度減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化（×200）

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子水平比較

治療后，與正常對照組比較，濕熱型模型組小鼠結(jié)腸組織INF-γ、IL-2、IL-4 和IL-17 水平均上升（P＜0.05），TGF-β 和IL-10 水平降低（P＜0.05）；與濕熱型模型組比較，濕熱型FMT 組和濕熱型5-ASA 組小鼠結(jié)腸組織INF-γ、IL-2、IL-4 和IL-17 水平均降低（P＜0.05），TGF-β 和IL-10 水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子水平比較（） pg/mL

表3 各組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子水平比較（） pg/mL

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與濕熱型模型組比較，bP＜0.05。

3 討論

UC 相關(guān)大腸癌的發(fā)病率逐年上升，是UC 患者死亡的主要原因。UC 的臨床表現(xiàn)為腹瀉、咳痰、膿血便、腹痛等，多見于青壯年。近年來，隨著生活方式和飲食習(xí)慣的改變，我國UC 發(fā)病率逐年上升，主要與遺傳、感染、環(huán)境和免疫有關(guān)［8-9］。中醫(yī)認(rèn)為UC 屬“久痢”范疇，大腸濕熱內(nèi)蘊(yùn)，氣血搏結(jié)壅滯，熱灼腸絡(luò)，可見便膿血；氣血升降不利，大腸傳導(dǎo)失司，可見腹痛、腹瀉。濕熱型UC 是最常見的UC 證型，但目前相關(guān)的動物模型研究較少。因此本研究在DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠模型的基礎(chǔ)上，加以濕熱環(huán)境以及高脂高糖飲食等飼養(yǎng)條件共同建立濕熱型UC 小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕熱型UC 小鼠模型比常規(guī)DSS 誘導(dǎo)UC 模型小鼠DAI 評分更高，且出現(xiàn)明顯膿血便、大便腥臭和肛溫升高等濕熱表現(xiàn)，表明濕熱型UC 小鼠模型建立成功。

目前UC 的一線臨床用藥主要為5-氨基水楊酸（5-ASA）類藥物，但存在治療效果有限以及治療周期長等問題，若加用激素治療則在激素依賴性風(fēng)險的同時造成腸道菌群紊亂［10］，而平衡腸道菌群正是UC 近年來的研究熱點(diǎn)。FMT 是對中藥金汁繼承和創(chuàng)新而來，研究表明FMT 是一種有效的腸道微生物穩(wěn)態(tài)干預(yù)手段，可改善腸道炎癥，且鮮少有不良反應(yīng)的報道［11］。Costello 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，采用厭氧制備供體FMT 灌腸治療8 周可明顯在不使用激素藥物的情況下緩解UC，不良反應(yīng)的總發(fā)生率為6.85%。本研究初步評估了金汁FMT 對濕熱型UC 小鼠模型腸道炎癥的作用，發(fā)現(xiàn)金汁FMT 干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量、大便性狀以及便血程度有了明顯好轉(zhuǎn)，這與周瑞等［13］的研究結(jié)果一致，表明金汁FMT 對濕熱型UC 有較好療效。同時本研究發(fā)現(xiàn)金汁FMT 的療效指數(shù)約為50.61%，顯著高于5-ASA 治療組，過去的研究表明金汁FMT 與5-ASA 類藥物在降低UC 小鼠的DAI 指數(shù)方面無明顯差距［14］，這可能與金汁性苦寒，清熱涼血效力較強(qiáng)，治療濕熱型UC 符合中醫(yī)辨證論治的原則，因而比5-ASA 類藥物療效更佳。

UC 的病理學(xué)特征為炎性CD4+細(xì)胞浸潤腸道，主要為輔助性T 細(xì)胞Th1 和Th17 細(xì)胞，且伴隨著Th2 細(xì)胞數(shù)量增加和調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（Treg）等免疫抑制細(xì)胞數(shù)量的減少［15］。CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)，導(dǎo)致Th1 和Th2 細(xì)胞亞群免疫調(diào)節(jié)失衡，促進(jìn)UC 發(fā)生發(fā)展［16］。INF-γ 和IL-2 由Th1 細(xì)胞分泌，IL-4 由Th2 細(xì)胞分泌，其血清水平與UC 病情程度成正比［17-18］。Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞與UC 發(fā)展也有關(guān)聯(lián)，其中Th17 細(xì)胞分泌IL-17，而UC 患者血清和腸黏膜中IL-17A 水平顯著升高，Treg 細(xì)胞則起關(guān)鍵性抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［19］。本研究中濕熱型UC小鼠結(jié)腸組織INF-γ、IL-2、IL-4 和IL-17 水平上升，TGF-β 和IL-10 水平降低，而經(jīng)金汁FMT 治療后這些炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平趨于正常，這與翁劍鋒等［20］的研究結(jié)果類似，表明金汁FMT 能夠調(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞相關(guān)促炎、抗炎因子水平，降低UC 小鼠結(jié)腸組織炎性反應(yīng)，推測可能與調(diào)控平衡Th1/Th2以及Th17/Treg 比例，介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，金汁FMT 對濕熱型UC 小鼠治療效果優(yōu)于5-ASA 藥物，可改善其結(jié)腸病理狀況，降低濕熱型UC 小鼠DAI 評分，調(diào)控結(jié)腸組織INF-γ、IL-2、IL-4 和IL-17、TGF-β 和IL-10 水平，改善結(jié)腸組織炎性反應(yīng)，推測可能與調(diào)控平衡Th1/Th2以及Th17/Treg 比例，介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)相關(guān)。