DDX5和DDX17在卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

朱國(guó)勝 邱麗影 資 捷

廣東省深圳市福田區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科 518045

卵巢癌是常見(jiàn)的且致死率最高的婦科惡性腫瘤,其中90%～95%為卵巢原發(fā)性癌,在中國(guó)女性癌癥死亡原因中排名第七位。卵巢癌患者早期無(wú)明顯的臨床癥狀,且缺乏有效的早篩手段,因此早期診斷比較困難,約70%的病人確診時(shí)已進(jìn)入晚期。其標(biāo)準(zhǔn)治療方案為細(xì)胞減滅術(shù)及藥物化療,但是經(jīng)過(guò)治療后大約25%病人在6個(gè)月后出現(xiàn)耐藥型復(fù)發(fā),病人5年生存率約為31%,10年生存率僅為15%[1-2]。卵巢癌對(duì)患者生命健康的危害及造成的社會(huì)負(fù)擔(dān)十分巨大,而缺乏早期診斷方法和化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌致死率高的關(guān)鍵因素,因此,探尋卵巢癌發(fā)病機(jī)制和尋找卵巢癌的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有非常重要的意義。

DDX5和DDX17是Dead-Box(DDX)RNA解旋酶家族中高度相似的兩個(gè)成員,它們對(duì)RNA具有多種調(diào)節(jié)功能,參與轉(zhuǎn)錄起始、選擇性剪切和miRNA加工等過(guò)程[3-4]。有研究表明,DDX5和DDX17在結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中出現(xiàn)異常高表達(dá),與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。目前關(guān)于DDX5和DDX17在卵巢癌組織中表達(dá)的研究少見(jiàn),具體機(jī)制尚未明確。本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢癌組織樣本和正常卵巢上皮樣本中DDX5和DDX17的mRNA表達(dá)水平,為揭示DDX5和DDX17通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA來(lái)促進(jìn)卵巢癌發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 樣本與方法

1.1 樣本與細(xì)胞系獲取 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)。選取37例因卵巢癌行切除的卵巢癌組織(試驗(yàn)組)及26例因良性病變行切除的正常卵巢上皮細(xì)胞(對(duì)照組)。試驗(yàn)組樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)病理學(xué)確診為原發(fā)性卵巢癌;(2)從未接受放療及化療。上述卵巢癌組織和正常卵巢上皮細(xì)胞的收集經(jīng)過(guò)患者知情同意后獲取。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)DDX5和DDX17基因mRNA表達(dá)水平：按照Thermo TRIzol RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取卵巢癌組織及正常卵巢上皮細(xì)胞總RNA,并用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以該產(chǎn)物作為模板分別對(duì)目的基因 DDX5 和 DDX17 進(jìn)行擴(kuò)增,使用GAPDH為內(nèi)對(duì)照,每樣本做3復(fù)孔。反應(yīng)體系：2xPower SYBR Green Master Mix 10μl,DDX5或DDX17的上下游引物均為2μl,β-actin 上下游引物均為2μl,cDNA 模版2μl,體系總體積為 20μl。在 PCR 儀中執(zhí)行以下程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性15s,60 ℃退火40s,72℃延伸40s,40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：DDX5 上、下游引物分別為5’-AGAGGTGATGGGCCTATTTGC-3’和5’-TCAAGCGACAAGCTCGACAAT-3’;DDX17上、下游引物分別為5’-GGATGTCTGCATGGAAAGTG-3’和5’-TCAGATCATCACAGCGTCTC-3’;內(nèi)對(duì)照GAPDH上、下游引物分別為5’-ATTTGGCTACAGCAACAGG-3’和5’-TTGAGCACAGGGTACTTTATT-3’。

通過(guò)計(jì)算 2-ΔΔCt值,量化基因相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行比較分析。由PCR擴(kuò)增曲線得到了每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因平均Ct值(閾值循環(huán)數(shù)),以一卵巢正常上皮細(xì)胞作為參照樣品,基因相對(duì)表達(dá)量ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,相對(duì)表達(dá)值ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組,mRNA 的相對(duì)表達(dá)量即為2-ΔΔCt。

1.2.2 建立DDX5和DDX17沉默細(xì)胞株,并檢測(cè)細(xì)胞活性：構(gòu)建針對(duì)DDX5和DDX17基因的pLKO.1 shRNA質(zhì)粒,將上述質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒(pLKO.1-Scramble)分別與包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2和 pCMV-VSVG 共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝,收集病毒上清。使用病毒上清感染卵巢癌細(xì)胞系SKOV3,48h后使用2μg/ml嘌呤霉素篩選5d,得到DDX5和DDX17基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞株,分別命名為shNC、shDDX5-1、shDDX5-2、shDDX17-1和shDDX17-2,用Western Blot驗(yàn)證。

將上述篩選獲得的5種不同細(xì)胞株按相同數(shù)量接種于96孔板中,在37℃下培養(yǎng)72h,加入CCK-8溶液(10μl)到96孔板的培養(yǎng)基中。然后將混合物在37℃孵育2h,并使用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度(OD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,兩實(shí)驗(yàn)組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DDX5和DDX17在卵巢癌細(xì)胞和正常卵巢上皮細(xì)胞的表達(dá)水平 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析37例卵巢癌細(xì)胞和26例卵巢正常上皮細(xì)胞中兩基因的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1)：相對(duì)于正常卵巢上皮細(xì)胞,卵巢癌組織中DDX5的表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而卵巢癌組織中DDX17的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

圖1 DDX5和DDX17 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

2.2 沉默DDX5和DDX17卵巢癌SKOV3細(xì)胞株的增殖能力 通過(guò)轉(zhuǎn)染分別使SKOV3細(xì)胞系中的DDX5和DDX17沉默,得到DDX5和DDX17基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞株,分別命名為shNC、shDDX5-1、shDDX5-2、shDDX17-1和shDDX17-2。Western Blot驗(yàn)證如下(見(jiàn)圖2)：與shNC組對(duì)比,DDX5沉默細(xì)胞株DDX5的表達(dá)明顯下調(diào),DDX17沉默細(xì)胞株DDX17的表達(dá)明顯下調(diào)。通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與shNC和DDX17沉默的卵巢癌細(xì)胞相比,DDX5沉默的SKOV3 細(xì)胞的增殖能力降低;DDX17沉默的卵巢癌細(xì)胞增殖能力與shNC對(duì)照組無(wú)明顯差別(見(jiàn)圖3)。

圖2 DDX5和DDX17基因沉默卵巢癌細(xì)胞系中DDX5和DDX17表達(dá)

圖3 DDX5和DDX17基因沉默卵巢癌細(xì)胞系體外增殖情況

3 討論

DDX5和DDX17的核心區(qū)域是DEAD box家族保守的模體,具有90%的同源性,而N端和C端區(qū)域則同源性較弱,分別約為60%和30%[7],它們可能與不同 RNA底物或者蛋白相互作用,導(dǎo)致在細(xì)胞中存在不同功能。DDX5和DDX17已被證實(shí)通過(guò)與自身高度調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子相互作用并調(diào)節(jié)其活性,參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始、選擇性剪切和miRNA加工等生物學(xué)過(guò)程;與組織發(fā)育成熟及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在癌癥中同時(shí)扮演著促進(jìn)和抑制的雙重角色[8-9]。

DDX5和DDX17可與腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物,調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá),從而影響上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞增殖。在結(jié)腸癌中,DDX5和DDX17結(jié)合β-catenin,刺激β-catenin調(diào)控的c-Myc、cyclin D1等原癌基因的表達(dá),從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖;在實(shí)驗(yàn)鼠中,敲低DDX5和DDX17 的表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,并減少腫瘤的形成。也有研究表明,血小板衍生因子(PDGF)會(huì)通過(guò)磷酸化DDX5促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程[10]。

隨著研究的深入,DDX5和DDX17在癌癥發(fā)展過(guò)程中的抑制作用逐漸被研究者揭示。DDX5和DDX17是抑癌基因p53的共轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)p53介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答至關(guān)重要,但DDX17同p53的相互作用要弱于DDX5,DDX5沉默會(huì)顯著抑制p53在DNA損傷應(yīng)答下對(duì)細(xì)胞周期抑制蛋白p21的轉(zhuǎn)錄激活作用[11]。另外,在許多癌癥細(xì)胞中,Hippo信號(hào)通路會(huì)發(fā)生突變而失去功能。Mori M的研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞中失活的Hippo信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致YAP蛋白聚集在細(xì)胞核中,而YAP蛋白會(huì)結(jié)合DDX17,使其無(wú)法參與miRNA加工過(guò)程,最終導(dǎo)致許多腫瘤抑制相關(guān)miRNA水平降低,使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加速;而過(guò)表達(dá)DDX17則會(huì)抑制Hippo通路失活引起的細(xì)胞過(guò)快生長(zhǎng)[12]。

本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)36例卵巢癌液氮標(biāo)本和27例正常卵巢上皮標(biāo)本中DDX5和DDX17 mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)對(duì)比正常卵巢上皮細(xì)胞,卵巢癌細(xì)胞中DDX5表達(dá)上升,而DDX17表達(dá)下降;沉默DDX5的卵巢癌細(xì)胞增殖能力降低,沉默DDX17的卵巢癌細(xì)胞增殖能力卻無(wú)明顯差別。這可能是DDX5可以通過(guò)無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)降低DDX17表達(dá)[13],卵巢癌中高水平的DDX5導(dǎo)致DDX17表達(dá)下降;也可能是在卵巢癌細(xì)胞中,DDX5和DDX17與不同的RNA底物或蛋白作用,在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著不同的作用。Iyer R Sumanth等發(fā)現(xiàn)DDX5沉默后極大地降低了質(zhì)粒穩(wěn)定性,而敲低DDX17對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性沒(méi)有明顯影響,DDX5促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞DNA復(fù)制[14]。在卵巢癌細(xì)胞中,DDX5影響質(zhì)粒穩(wěn)定性,促進(jìn)DNA復(fù)制因子表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,DDX5的沉默會(huì)損害DNA復(fù)制因子表達(dá),導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞增殖能力下降;DDX17對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性沒(méi)有明顯影響,因此,沉默DDX17對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力影響不大。

本研究中卵巢癌細(xì)胞DDX5的表達(dá)上升,DDX17的表達(dá)下降,而既往研究中兒童髓母細(xì)胞瘤、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤細(xì)胞DDX5和DDX17的表達(dá)水平均升高[15-16],可能是DDX5/DDX17既可作為自身高度調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的激活因子,也可為抑制因子,其功能受細(xì)胞環(huán)境、DDX5/DDX17翻譯后的修飾、特異的啟動(dòng)子被調(diào)控等因素影響[17]。卵巢癌細(xì)胞中DDX5和DDX17的異常表達(dá)提示DDX5和DDX17可能成為卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)志物。沉默DDX5的卵巢癌細(xì)胞增殖能力降低,說(shuō)明在卵巢癌中,高表達(dá)的DDX5可能扮演一個(gè)癌基因的角色,起促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生增殖的作用,可作為卵巢癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

綜上所述,DDX5和DDX17在卵巢癌組織中顯著異常表達(dá),DDX5的表達(dá)情況會(huì)影響卵巢癌細(xì)胞的增殖,對(duì)卵巢癌的早期診斷具有一定價(jià)值。在后期研究中需進(jìn)一步探究DDX5和DDX17在卵巢癌發(fā)生中的作用機(jī)制,探討上下游的可能的調(diào)控因子,明確DDX5和DDX17通過(guò)哪個(gè)信號(hào)軸調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)研究找到卵巢癌早期診斷標(biāo)志物,爭(zhēng)取通過(guò)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌,對(duì)后續(xù)開(kāi)展靶向治療提供基礎(chǔ),挽救更多患者的生命,為社會(huì)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。