微流控芯片技術(shù)檢測(cè)蝦肝腸胞蟲(chóng)及其在浙江省對(duì)蝦流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

孫福英，白 斐，祝 波，盧先東，錢 冬

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315832；2.寧波愛(ài)基因科技有限公司，浙江寧波 315105）

蝦肝腸胞蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）屬于真菌界（Fungi）微孢子蟲(chóng)門（Microsporidia）單倍期綱（Haplophasea）壺孢目（Chytridiopsida）腸胞蟲(chóng)科（Enterocytozoonidae）腸胞蟲(chóng)屬（Enterocytozoon），是一種可感染多種真核生物的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)[1-3]。EHP 主要感染對(duì)蝦的肝胰腺，感染較嚴(yán)重時(shí)也感染中腸、血淋巴、腮和肌肉等組織[4]。對(duì)蝦感染EHP 后，可與急性肝胰腺壞死弧菌共感染，死亡率可明顯上升，兩者具有累加效應(yīng)[5]。

EHP 個(gè)體微小，給顯微鏡檢測(cè)造成較大困難，EHP 傳播迅速，危害大，需要快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)。常規(guī)的PCR 檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，熒光定量PCR 靈敏度高，但上述檢測(cè)技術(shù)均需要在實(shí)驗(yàn)室完成。微流控芯片技術(shù)也叫芯片實(shí)驗(yàn)室（lab on a chip，LOC），是一種以在微米尺度空間完成對(duì)化學(xué)或生物樣品的常規(guī)化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)室功能為主要特征的技術(shù)平臺(tái)[6]。其把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程。

為建立快速、便捷、定量檢測(cè)EHP 的方法，方便養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)EHP 的流行規(guī)律進(jìn)行定量評(píng)估，本文嘗試建立EHP 定量檢測(cè)的微流控芯片檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

微流控?zé)晒鈾z測(cè)儀，寧波愛(ài)基因科技有限公司；熒光定量PCR，瑞士Roche 公司；PCR 儀，德國(guó)Analitik Jena AG 公司；NanoDrop 微量UV-Vis 分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher 公司。

熒光等溫?cái)U(kuò)增液，寧波愛(ài)基因科技有限公司；通用SYBR qPCR預(yù)混液，南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，美國(guó)Omege公司；pMD19-T Vecto 專用載體，日本TaKaRa 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和篩選

腸胞蟲(chóng)采用GenBank 公布片段，選擇高度保守基因序列片段，PrimerExplorV5 在線軟件設(shè)計(jì)引物。一共設(shè)計(jì)4 條引物，每條引物中均包含上/下游外引物F3/B3、上/下游內(nèi)引物FIP/BIP，具體設(shè)計(jì)情況見(jiàn)表1。引物由杭州有康生物公司合成，通過(guò)加熱干燥的方式將預(yù)篩選引物包埋于反應(yīng)室中，篩選出最佳反應(yīng)引物。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的合成

取提取的腸胞蟲(chóng)基因片段的克隆采用高保真酶Pfu 預(yù)混液，進(jìn)行EHP 目的基因擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，與pMD19-T載體連接，后轉(zhuǎn)至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，送生物科技有限公司測(cè)序鑒定，對(duì)于鑒定正確的重組質(zhì)粒，名為pMD-EHP，對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定，拷貝數(shù)計(jì)算，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 微流控芯片檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

樣本充分均質(zhì)，試劑于室溫下解凍，充分混勻并短暫離心后使用。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

微流控芯片檢測(cè)儀恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光，形成熒光檢測(cè)擴(kuò)增曲線。微流控芯片按閾值時(shí)間（Ct）判定樣品：1）陽(yáng)性——反應(yīng)孔出現(xiàn)Ct＜60，有明顯的S 型擴(kuò)增曲線；2）陰性——反應(yīng)孔出現(xiàn)Ct ＞60，無(wú)擴(kuò)增曲線。

選擇腸胞蟲(chóng)（EHP）、對(duì)蝦通用型傳染皮下壞死（IHHNV-U）、虹彩病毒（DIV1）、弧菌（Vibrio）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒加入樣本內(nèi)標(biāo)孔，按照儀器操作說(shuō)明書(shū)運(yùn)行程序，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 微流控靈敏度測(cè)試

選擇無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，用S01-03-06-18 蝦病四聯(lián)（EHP、IHHNV-U、DIV1、Vibrio）微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒QT 進(jìn)行定標(biāo)，根據(jù)優(yōu)化條件和構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定擴(kuò)增腸胞蟲(chóng)陽(yáng)性核酸的最低檢出限。

1.2.5 微流控反應(yīng)特異性與穩(wěn)定性測(cè)試

特異性實(shí)驗(yàn)是為了檢查該方法與其他水生動(dòng)物病原之間是否存在交叉反應(yīng)，分別以腸胞蟲(chóng)、急性肝胰腺壞死、對(duì)蝦通用型傳染、對(duì)蝦感染型傳染、對(duì)蝦白斑綜合癥、十足目虹彩病毒和羅氏沼蝦諾病毒的DNA為模板，使用優(yōu)化條件檢測(cè)其特異性。

使用稀釋至104copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒在1次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)16 次，通過(guò)分析檢測(cè)閾值時(shí)間（Ct）評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

2020—2022 年，分別在浙江省臺(tái)州市、舟山市、嘉興市、寧波市、杭州市采樣，對(duì)調(diào)查采集的腸胞蟲(chóng)患病對(duì)蝦、其他疑似發(fā)患病蝦、藥物治療后的蝦共37批，用微流控芯片進(jìn)行腸胞蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)腸胞蟲(chóng)陽(yáng)性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 微流控引物篩選結(jié)果

篩選和比較腸胞蟲(chóng)微流控檢測(cè)的多套引物的Ct值，如圖1 所示。結(jié)果表明，引物1 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間比較長(zhǎng)，Ct 值在22 min 左右；引物2 反應(yīng)時(shí)間短，Ct 值在12 min左右，具有明顯的擴(kuò)增曲線，但曲線比較分散；引物3 無(wú)擴(kuò)增峰；引物4 反應(yīng)時(shí)間短，Ct 值在11 min 左右，具有明顯的擴(kuò)增曲線，且曲線比較集中。因此引物4為最佳引物，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用引物4。

圖1 腸胞蟲(chóng)微流控檢測(cè)引物篩選比較

2.2 EHP 微流控芯片檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

用S01-03-06-18 蝦病四聯(lián)（EHP、IHHNV-U、DIV1、Vibrio）微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒QT 進(jìn)行定標(biāo)，4 種病原標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。微流控芯片最低檢出限為3.23×100copies·μL-1。

圖2 微流控檢測(cè)腸胞蟲(chóng)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 微流控特異性與重復(fù)性結(jié)果

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，除EHP 為模板的陽(yáng)性樣品熒光定量出現(xiàn)擴(kuò)增峰外，其他模板樣品均無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，說(shuō)明微流控芯片檢測(cè)方法的特異性良好。重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)圖4，取104copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒在重復(fù)檢測(cè)16 次，Ct 值15.40±0.12 min，變異系數(shù)0.78，陽(yáng)性質(zhì)粒均出現(xiàn)了典型S 型擴(kuò)增，陰性對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增，表明建立的EHP 微流控芯片方法有良好的重復(fù)性，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖3 微流控芯片檢測(cè)EHP 的特異性

圖4 微流控芯片16 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線

2.4 微流控技術(shù)在蝦肝腸胞蟲(chóng)流行病學(xué)研究中的應(yīng)用

如表2 所示，2020—2022 年共采集檢測(cè)樣品37批次，感染20 批次，腸胞蟲(chóng)的感染率為54.05%。其中，2020 年共調(diào)查11 批次，感染6 批次，檢出率54.55%；2021 年共調(diào)查12 次，感染9 批次，感染率為75.00%；2022 年共調(diào)查14 批次，感染5 批次，感染率為35.71%。

表2 浙江省對(duì)蝦采樣及腸胞蟲(chóng)感染情況調(diào)查

對(duì)所采集的37 批樣本進(jìn)行分區(qū)域病原檢測(cè)，結(jié)果如表3 所示，腸胞蟲(chóng)的染率達(dá)54.05%，對(duì)蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV-U）檢出率32.43%，弧菌（Vibrio）檢出率為45.95%。三門縣和舟山市的腸胞蟲(chóng)感染率比較高，其次是寧波市、杭州市。除嘉興市未出現(xiàn)IHHNV-U 感染，其他地方均有感染。

表3 浙江省部分對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)域病原檢測(cè)情況

3 結(jié)論與討論

EHP 孢子大小僅為0.7 μm×1.1 μm，感染無(wú)明確易判斷的臨床癥狀，很難觀察。雷燕等根據(jù)GenBank 中對(duì)蝦腸道上皮細(xì)胞的EHP 基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化PCR 擴(kuò)增條件，建立了EHP 的PCR 檢測(cè)方法[7]。Tangprasittipap 等利用套式PCR 檢測(cè)方法，開(kāi)展了EHP 診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查[8]。然而PCR 具有模板質(zhì)量和引物設(shè)計(jì)要求較高、需擴(kuò)展特定DNA、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。劉丹等應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌[9]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏性高和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，但由于其預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)，且需要專業(yè)的檢測(cè)人員操作，不易在現(xiàn)場(chǎng)及基層推廣[10]。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，理想的診斷檢測(cè)技術(shù)應(yīng)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、使用成本低、操作簡(jiǎn)單快捷、可用于任何環(huán)境條件下同時(shí)容易獲得操作儀器等特點(diǎn)[11]。微流控芯片可以設(shè)計(jì)多條微通道，且微通道之間結(jié)構(gòu)封閉，同一個(gè)微流控芯片可以對(duì)同一樣本同時(shí)進(jìn)行不同項(xiàng)目的檢測(cè)，有效避免交叉污染，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率[12]。微流控芯片的微型化提高了傳熱效率，節(jié)約了試劑成本和樣本，且不需要大量的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，因此大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)集成的微流體芯片大大降低了生產(chǎn)成本[13]。

對(duì)天津市2015 年和2016 年蝦肝腸胞蟲(chóng)的流行情況調(diào)查表明，EHP 的檢出率分別為56.96%、69.52%[14]。2019 年，江蘇省溫室養(yǎng)殖蝦類中EHP 患病率為56.3%，土塘養(yǎng)殖蝦類中EHP 患病率為79.5%[15]。本實(shí)驗(yàn)室在2020—2022 年共采集檢測(cè)樣品37 批次，腸胞蟲(chóng)的感染率為54.05%。數(shù)據(jù)顯示，EHP 引發(fā)的感染病已嚴(yán)重威脅我國(guó)蝦類的健康養(yǎng)殖。此外，本文針對(duì)浙江省不同地區(qū)對(duì)蝦流行病學(xué)特點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，三門縣和舟山市的腸胞蟲(chóng)感染率比較高，除嘉興市未出現(xiàn)對(duì)蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒感染，其他地方均有感染。