擴(kuò)張型心肌病病人CD247基因多態(tài)性與遺傳易感的關(guān)系

李超民,李淵博,董曉華,徐林杰,韓 勇,羅 薇

目前,關(guān)于擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)的發(fā)病機(jī)制仍在不斷研究中,遺傳因素和非遺傳因素均是其發(fā)生的原因[1]。有研究顯示,自身免疫是參與DCM心力衰竭發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制[2]。T細(xì)胞在DCM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著雙重作用,一方面,T細(xì)胞可幫助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體;另一方面,它們釋放細(xì)胞因子以誘導(dǎo)纖維化[3]。全基因組分析顯示了DCM與T細(xì)胞分化、增殖和激活相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)[4]。T細(xì)胞受體T3 zeta 鏈(CD3ζ),也稱(chēng)為CD247,對(duì)T細(xì)胞受體-CD3(TCR/CD3)復(fù)合物的組裝、表面表達(dá)和信號(hào)級(jí)聯(lián)重要[5],該途徑異常導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙和自身免疫性疾病發(fā)展[5]。相關(guān)研究已證實(shí),CD247與多種自身免疫性疾病之間存在關(guān)聯(lián),包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[6]。然而,CD247基因突變是否與DCM的易感性相關(guān)報(bào)道較少。本研究假設(shè)是CD247通過(guò)自身免疫的病理過(guò)程介導(dǎo)不良的心臟重塑,探討了已證實(shí)與自身免疫疾病相關(guān)的3個(gè)CD247單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms,SNP)rs1052237[7]、rs2056626[8]和rs864537[9]是否與DCM的易感性相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年3月—2019年4月在我院連續(xù)招募同意參與基因研究的279例DCM病人作為病例組。DCM入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESC)工作組關(guān)于的DCM臨床診斷[10];排除標(biāo)準(zhǔn)：非DCM、冠心病、原發(fā)性瓣膜性心臟病、先天性心臟病、肺源性心臟病、心包炎、腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病。臨床評(píng)估、實(shí)驗(yàn)室檢查、超聲心動(dòng)圖和冠狀動(dòng)脈造影(或冠狀動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層造影)及心臟磁共振成像和心臟放射性核素檢查(如有臨床指征)進(jìn)行診斷評(píng)估。所有病人的電子病歷均包括家族史。對(duì)照組為同期于我院進(jìn)行體檢的健康者363名,通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查、體檢、血清生化指標(biāo)和超聲心動(dòng)圖評(píng)估,均為身體健康;排除標(biāo)準(zhǔn)：心血管疾病史或癥狀、服用任何心血管疾病藥物及糖尿病診斷。測(cè)定超聲心動(dòng)圖參數(shù),包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和心臟內(nèi)部尺寸。

1.2 SNP基因分型 采集血液至含有乙二胺四乙酸(EDTA)的容器中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)鹽析法從外周靜脈血的白細(xì)胞中提取基因組DNA,在iPLEX SNP基因分型分析儀(美國(guó)Sequenom公司)上使用Sequenom-MassARRAY系統(tǒng)進(jìn)行SNP基因分型。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和相關(guān)延伸反應(yīng)的所有分析均由在線分析設(shè)計(jì)套件軟件(Sequenom)設(shè)計(jì),引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。根據(jù)Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)提供的標(biāo)準(zhǔn)方法,進(jìn)行PCR條件、等位基因特異性引物延伸及其產(chǎn)物分析。使用MassARRAY Typer 4.0軟件(Sequenom)對(duì)產(chǎn)生的質(zhì)譜進(jìn)行處理和分析,測(cè)定峰識(shí)別和等位基因。為了確保獲得的基因型是有效的,在5%的DNA樣本中對(duì)各個(gè)SNP進(jìn)行重復(fù)的基因型分析,所有結(jié)果完全一致,對(duì)所有其他數(shù)據(jù)進(jìn)行盲法基因分型?；蚍中驼{(diào)用率為99.0%～99.5%。

1.3 隨訪 第3個(gè)月、第6個(gè)月、第1年通過(guò)訪問(wèn)、電話或醫(yī)療記錄進(jìn)行隨訪。記錄之后每年生存狀況和死亡病因,預(yù)后評(píng)估包括全因死亡或心血管疾病死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用雙尾獨(dú)立t檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組之間連續(xù)變量的差異。采用Kruskal-Wallish檢驗(yàn)比較3種遺傳模式下基因型間非正態(tài)連續(xù)變量的差異。分類(lèi)變量的比較采用χ2檢驗(yàn)。通過(guò)χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組中每個(gè)SNP與Hardy-Weinberg平衡(HWE)的偏差。χ2檢驗(yàn)評(píng)估病例組和對(duì)照組等位基因和基因型頻率的差異。采用Logistic回歸分析不同遺傳模式或等位基因指定的基因型對(duì)DCM易感性的影響。Kaplan-Meier圖和多變量Cox回歸分析用于根據(jù)基因型定義的亞組的生存分析。顯著性閾值設(shè)定為P<0.05。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)控制用于調(diào)整多次測(cè)試。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較(見(jiàn)表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組CD247基因型分布 DCM病人中,rs1052237的G等位基因和rs2056626的C等位基因頻率較低(P<0.05),詳見(jiàn)表2。加性模型中,rs1052237和rs2056626與DCM的低易感性相關(guān)(P值分別為0.045,0.040),并在隱性遺傳模型中傾向于降低DCM的易感性(P值分別為0.052,0.064)。詳見(jiàn)表3。

表2 兩組CD247基因多態(tài)性等位基因頻率比較 單位：例(%)

表3 兩組CD247基因型分布 單位：例

2.3 CD247基因多態(tài)性與DCM病人血清CD247水平、臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián) 在加性模型和顯性模型下,rs864537的A變異體與DCM病人的血清CD247水平較低相關(guān)(P值分別為0.032,0.012)。rs1052237的G變異體與DCM病人血清CD247低水平相關(guān)(加性模型,P=0.020;顯性模型,P=0.020;隱性模型,P=0.037)。詳見(jiàn)表4。rs864537的AA基因型與較低的LVEF(隱性模型,P=0.018;加性模型,P=0.039),較高的左室舒張末期內(nèi)徑(加性模型,P=0.033)有關(guān)。詳見(jiàn)表5。

表4 DCM病人CD247基因多態(tài)性與血清CD247水平的關(guān)系(n=279)

表5 DCM 病人CD247基因多態(tài)性與心功能指標(biāo)的關(guān)系

2.4 CD247基因多態(tài)性對(duì)DCM病人預(yù)后的影響 所有DCM病人隨訪時(shí)間為(20.6±10.6)個(gè)月,其中60例死于其他原因,57例死于心血管疾病。Kaplan-Meier和多變量Cox回歸分析表明,CD247基因的3個(gè)SNP多態(tài)性對(duì)DCM病人的全因死亡或心血管死亡無(wú)影響。詳見(jiàn)表6。

表6 CD247基因多態(tài)性對(duì)DCM病人預(yù)后的影響

3 討 論

DCM是一種病因未明的自身免疫性疾病,有證據(jù)支持遺傳因素在DCM易感性和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[11]。目前已知與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相關(guān)的基因與DCM相關(guān),但可解釋疾病易感性的遺傳貢獻(xiàn)低于50%[11]。因此,利用全基因組篩查或候選基因方法鑒定新型DCM易感性基因是目前的研究熱點(diǎn)。CD247是T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵組成部分,對(duì)TCR-CD3復(fù)合物的組裝和表面表達(dá)重要[7]。有研究表明,所有TCR亞單位中,只有CD247的表達(dá)被特異性下調(diào),且這些T細(xì)胞影響了TCR介導(dǎo)的功能[12]?？紤]到CD247在T細(xì)胞反應(yīng)及自身免疫性疾病中的作用,為闡明該基因在DCM易感性中的作用,有必要分析DCM病人的CD247基因多態(tài)性。本研究發(fā)現(xiàn)：rs1052237的G變體和rs2056626的C變體可能與DCM的低易感性有關(guān);rs864537的AA基因型可能與DCM病人的LVEF降低有關(guān)。

具有rs1052237的G變體DCM病人血清CD247水平較低,但在健康受試者中并非如此,表明該SNP可能僅在病理狀態(tài)下通過(guò)影響CD247基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。rs1052237位于CD247基因的近5′基因區(qū)域,其確切功能尚未明確,且其是否影響DCM疾病狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能有待進(jìn)一步分析。

SNP rs2056626的次要等位基因與DCM的低易感性有關(guān),其位于N端重復(fù)結(jié)構(gòu)域之一,表明其可能參與了TCR信號(hào)的調(diào)節(jié)[13]。有研究顯示,C等位基因的攜帶與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜T細(xì)胞表面CD3ζ密度降低有關(guān)[13]。本研究中DCM rs2056626基因型病人血清CD247水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測(cè)是由于血清CD247水平不僅與基因型有關(guān),而且與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和DCM病人不同的疾病狀態(tài)和病理過(guò)程有關(guān)。雖然SNP rs2056626的變異未改變血清CD247水平,但不能排除其可能通過(guò)改變心肌CD247的組織水平影響疾病易感性,需在今后研究中得到證實(shí)。有研究顯示,SNP rs864537的遺傳變異可改變一般人群血清CD247水平[14]。本研究結(jié)果顯示,這些變體與DCM病人中較低的CD247水平相關(guān),且進(jìn)一步分析表明,rs864537的次要變異A等位基因與較低的LVEF相關(guān),與血清水平變化一致。

盡管血清CD247水平是心力衰竭預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15],但本研究中的生存分析未發(fā)現(xiàn)CD247基因多態(tài)性與DCM的預(yù)后的關(guān)聯(lián),提示基因突變并非是決定CD247血清水平的唯一因素,CD247水平由疾病嚴(yán)重程度決定。

本研究的局限性：與DCM易感性相關(guān)的顯著CD247基因多態(tài)性,但不能排除假陽(yáng)性結(jié)果,遺傳分析中的統(tǒng)計(jì)顯著性較小,因此今后在獨(dú)立樣本集中進(jìn)行重復(fù)研究以確認(rèn)結(jié)果;未評(píng)估組織中CD247基因表達(dá),因此不能從本研究中確認(rèn)CD247基因中的顯著SNP影響了心臟組織的基因表達(dá)并直接參與了纖維化和炎癥;未進(jìn)行功能分析CD247基因中突變等位基因的影響,無(wú)法闡明CD247基因多態(tài)性與DCM關(guān)聯(lián)的確切機(jī)制;本研究是一項(xiàng)以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照/隊(duì)列研究,選擇偏倚是不可避免的。

總之,本研究為CD247基因與DCM的潛在臨床關(guān)聯(lián)提供了一些依據(jù),需進(jìn)行全面的分析以確認(rèn)本研究的結(jié)果是合理的。今后需探討SNP潛在的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。