梔子提取物對(duì)局灶性腦缺血損傷模型大鼠凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能的影響

王碰治,侯志婷,黃家福,林毅勝

腦缺血主要指腦血液供應(yīng)不足,難以供應(yīng)腦組織正常的生理代謝,進(jìn)而發(fā)生一系列癥狀的綜合征[1]。腦缺血為常見(jiàn)的中老年人疾病,長(zhǎng)期嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,近年來(lái)該病發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì),是我國(guó)目前重點(diǎn)防治的疾病之一[2]。腦缺血主要危害腦組織的健康,輕微局灶性腦缺血無(wú)明顯癥狀,嚴(yán)重的局灶性腦缺血引起凝血及纖溶系統(tǒng)異常,造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,進(jìn)一步破壞抗凝、抗血栓作用,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能等多種功能性障礙,因此,凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能是判斷局灶性腦缺血的重要指標(biāo)[3]。目前局灶性腦缺血以藥物治療為主,但手段單一,造成治療效果不完善,近年來(lái)采用中草藥配合預(yù)防腦血管疾病,應(yīng)用于臨床治療的研究逐漸增多,已成為研究的熱點(diǎn)[4]。

梔子屬茜草科植物,作為中國(guó)藥典收錄品種,在我國(guó)民間有悠久的用藥歷史[5]?，F(xiàn)代研究表明,梔子提取物(gardenia extract,GE)主要含有梔子苷類(lèi)、西紅花苷類(lèi)、梔子素類(lèi)等化學(xué)成分,具有多種藥理活性,可促進(jìn)血液循環(huán),防治動(dòng)脈粥樣硬化和腦出血等[6]。盡管GE的藥理活性已被廣泛證實(shí),但其對(duì)腦缺血組織的作用機(jī)制尚未明確。GE是否參與調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮活性、促進(jìn)生物凝血功能,進(jìn)而改善腦組織缺血損傷的機(jī)制尚未明確[7-8]。本研究以局灶性腦缺血損傷模型大鼠為研究對(duì)象,觀察GE對(duì)凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 GE為實(shí)驗(yàn)室采集新鮮干燥的梔子制備(UPLC測(cè)定有效成分梔子苷含量>60%,西紅花苷>10%),一氧化氮(nitric oxide,NO)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ER0148)購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司,大鼠血管壁血栓素A2(vascular wall thromboxane A2,TXA2)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：BH-R101190)購(gòu)自上海博湖生物科技有限公司,凝血酶活性熒光檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：AS-72130)購(gòu)自AnaSpec公司,內(nèi)皮組織纖維溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PAT)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ZK-R3361)購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司,纖維溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor,PAI)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ml003024)和大鼠血漿前列環(huán)素I2(prostaglandin I2,PGI2)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：TW3899)購(gòu)自上海通蔚生物科技有限公司,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DG5033A,南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

1.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建 清潔級(jí)SD大鼠48只[購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院,許可證號(hào)SYXK(津)2017-0005],隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(model組)、GE高劑量組(GE-H組)、GE低劑量組(GE-L組),每組12只。所有大鼠麻醉處理,sham組大鼠頸部切開(kāi),分離左側(cè)總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,保留完整血管,縫合各層皮下組織和肌肉,消毒處理。分離model組、GE-H組、GE-L組大鼠左側(cè)總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后,使用電熱燒灼器燒掉頸外動(dòng)脈分支,分離頸外動(dòng)脈主干段,結(jié)扎處理。剪開(kāi)一個(gè)小口,插入尼龍線栓子,插入深度為20 mm,阻斷供血1 h后恢復(fù)大腦血流,縫合各層皮下組織和肌肉,消毒處理。待動(dòng)物蘇醒,參照Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,0分：正常,無(wú)神經(jīng)功能缺損;1分：右側(cè)前爪無(wú)法完全舒展,輕度神經(jīng)功能缺損;2分：行走時(shí),大鼠朝右側(cè)轉(zhuǎn)圈,中度神經(jīng)功能缺損;3分：行走時(shí),大鼠身體朝右側(cè)傾倒,重度神經(jīng)功能缺損;4分：不能自主行走,喪失部分意識(shí)。GE-L組和GE-H組分別在大鼠腦缺血處理后每日腹腔注射10 mg/mL、100 mg/mL的GE 1 mL,連續(xù)注射2周;sham組和model組腹腔注射等量生理鹽水。2周后再采用Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定model組、GE-H組、GE-L組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。

1.3 凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能指標(biāo) 凝血功能指標(biāo)：藥物注射治療2周后,剪斷大鼠尾部末端,迅速收集300 μL血液,采用凝血酶活性熒光檢測(cè)試劑檢測(cè)凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)、凝血酶含量及凝血因子Ⅹa含量;將鼠尾靜脈血滴到載玻片上,每隔10 s使用大頭針由外側(cè)向內(nèi)側(cè)輕挑,直至出現(xiàn)纖維蛋白絲為止,記錄用時(shí)即為凝血時(shí)間(coagulation time,CT)。同時(shí)使用濾紙每隔10 s吸附尾尖溢出血液,直至出血停止,記錄用時(shí)即為出血時(shí)間(bleeding time,BT)。血管內(nèi)皮功能指標(biāo)：凝血功能指標(biāo)檢測(cè)后,斷頭處死大鼠,分離取出大腦動(dòng)脈環(huán)(Willis),按照ELISA檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)Willis動(dòng)脈環(huán)NO、eNOS及血漿PGI2含量和內(nèi)皮組織t-PAT、TXA2及PAI活性。

1.4 腦組織病理學(xué)變化 處死大鼠后迅速開(kāi)顱,解剖獲取腦組織,分離腦缺血區(qū)組織,使用4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脫水,包埋劑處理后切片,蘇木精染色3 min,清水沖洗2 min,低濃度鹽酸乙醇分化處理,清水沖洗直至返藍(lán),0.5%伊紅染色3 min,清水沖洗2 min,乙醇梯度脫水,二甲苯染色透明,中性樹(shù)脂封片,置于顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較 與sham組比較,model組CT、BT、TT縮短,凝血酶生成及內(nèi)源性、外源性凝血因子Ⅹa生成升高(P<0.05);與model組比較,GE-H組和GE-L組CT、BT、TT延長(zhǎng),凝血酶生成及內(nèi)源性/外源性凝血因子Ⅹa生成降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組大鼠腦血管內(nèi)皮功能指標(biāo)比較 與sham組比較,model組t-PAT、PGI2、NO、eNOS降低,PAI、TXA2升高(P<0.05);與model組比較,GE-H組和GE-L組t-PAT、PGI2、NO、eNOS升高,PAI、TXA2降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦血管內(nèi)皮功能指標(biāo)比較(±s)

2.3 各組大鼠治療前后Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分比較 與sham組比較,model組治療前后Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分升高;sham組和model組治療前后Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與治療前比較,GE-H組和GE-L組治療后Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與model組治療后比較,GE-H組和GE-L組治療后Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.4 局灶性腦缺血損傷模型大鼠腦組織病理變化 sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,未出現(xiàn)壞死灶及腦出血組織,神經(jīng)細(xì)胞排列緊密,無(wú)明顯的細(xì)胞核融合現(xiàn)象;model組大鼠腦組織出現(xiàn)壞死灶,發(fā)生局部腦出血組織,腦出血組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞排列松散,細(xì)胞核融合;GE-H組和GE-L組未見(jiàn)壞死灶,少量神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,無(wú)明顯的細(xì)胞核融合現(xiàn)象;GE-H組腦組織損傷情況及細(xì)胞核融合現(xiàn)象較model組明顯好轉(zhuǎn),且優(yōu)于GE-L組。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組腦組織病理學(xué)變化(×200)

3 討 論

腦缺血癥狀復(fù)雜多樣,常造成病人多方面功能衰弱甚至缺失,使病人出現(xiàn)凝血功能異常,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞破損,內(nèi)皮功能異常[9]。GE具有多種藥理活性,其中主要的有效成分梔子苷證實(shí)具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和修復(fù)的作用[10],但其作用機(jī)制和作用途徑尚未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)凝血功能和腦血管內(nèi)皮功能指標(biāo),結(jié)合HE染色觀察,觀察GE對(duì)局灶性腦缺血大鼠功能的影響。

凝血過(guò)程主要分為凝血酶的生成、酶原的激活及纖維蛋白的形成[11]。為了觀察凝血功能的變化,本研究通過(guò)檢測(cè)BT、CT得到凝血過(guò)程中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),判斷各組間凝血用時(shí)的差異。凝血酶將血漿中的可溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)換為不溶性纖維蛋白,從而快速凝血,故采用TT反映纖維蛋白的形成過(guò)程,判斷纖維蛋白形成時(shí)間[12]。凝血因子Ⅹ在出血時(shí)被凝血酶原激活為凝血因子Ⅹa,與血小板共同參與凝血,修復(fù)損傷[13],因此使用凝血酶含量及凝血因子Ⅹa含量判斷凝血酶生成量及凝血酶原激活情況。本研究結(jié)果顯示,腦缺血損傷處理后大鼠CT、BT、TT縮短,凝血酶和凝血因子Ⅹa生成升高,提示腦缺血損傷過(guò)程中凝血作用異常增強(qiáng);GE處理后,CT、BT、TT延長(zhǎng),凝血酶和凝血因子Ⅹa含量降低,表明GE使局灶性腦缺血損傷大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了明顯的抗凝血效應(yīng),改善了體內(nèi)的凝血功能。

NO是生物體內(nèi)重要的舒張血管因子,在內(nèi)皮血管中分泌,參與調(diào)節(jié)血管舒張程度,對(duì)血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等具有抑制作用,而eNOS直接催化NO活性,兩者可作為判斷腦血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)[14]。PAI是一種纖溶酶原激活抑制物,濃度過(guò)高時(shí)抑制纖溶系統(tǒng)活性,是形成血栓、破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能的主要因子之一[15]。PGI2和t-PAT均由內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放,其中PGI2與TXA2維持動(dòng)態(tài)平衡,平衡失調(diào)直接導(dǎo)致血栓及內(nèi)皮損傷[16],而t-PAT可促進(jìn)纖維蛋白的溶解,降解纖維蛋白原和凝血因子,降低凝血作用[17]。本研究將t-PAT活性的增強(qiáng)、PAI表達(dá)下降及PGI2高表達(dá)作為判斷腦血管內(nèi)皮功能正常的重要指標(biāo),同時(shí)t-PAT也可作為判斷凝血功能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,腦缺血損傷處理后t-PAT、PGI2、NO、eNOS降低,PAI、TXA2升高,表明腦缺血損傷處理導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮功能?chē)?yán)重受損;GE處理后,t-PAT、PGI2、NO、eNOS升高,PAI、TXA2降低,表明GE可修復(fù)局灶性腦缺血損傷大鼠腦血管內(nèi)皮功能,使腦血管內(nèi)皮功能逐漸恢復(fù)正常。t-PAT含量變化進(jìn)一步證實(shí)了GE對(duì)局灶性腦缺血損傷大鼠凝血功能的改善作用。經(jīng)GE處理后,HE染色結(jié)果證實(shí),大鼠腦組織損傷情況減輕,且Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分結(jié)果表明,大鼠神經(jīng)功能得到改善,說(shuō)明GE通過(guò)改善凝血功能和內(nèi)皮功能可減輕局灶性腦缺血損傷大鼠的腦組織損傷并提高神經(jīng)功能。

綜上所述,GE作用后,可延長(zhǎng)CT、BT、TT,降低凝血酶和凝血因子含量,發(fā)揮明顯的抗凝血作用;增強(qiáng)NO、eNOS活性,舒張血管,提高t-PAT、PGI2表達(dá)同時(shí)抑制PAI、TXA2的表達(dá),改善血管內(nèi)皮功能,調(diào)節(jié)纖溶功能,進(jìn)而改善局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織病變情況,恢復(fù)神經(jīng)功能。GE在治療腦血管疾病中具有很大的潛力,而GE能否通過(guò)其他作用途徑間接參與調(diào)控凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能,進(jìn)而恢復(fù)神經(jīng)功能,或通過(guò)改善缺血腦組織其他功能緩解腦組織受損,需要在今后的研究中進(jìn)一步深入挖掘和探討。