TMAO通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路干預(yù)急性心肌梗死病人動(dòng)脈斑塊的作用機(jī)制

邵良發(fā),鄢高亮,張啟杰,楊宏飛

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是發(fā)展中國(guó)家死亡和致殘的主要原因[1]。除了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小外,斑塊穩(wěn)定性也是AMI的主要危險(xiǎn)因素[2]。因此,尋找有效的方法提高頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性是十分必要的。有研究表明,血漿三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide,TMAO)水平在動(dòng)脈粥樣硬化病人中升高,且與動(dòng)脈粥樣硬化加速有關(guān)[3]。有研究報(bào)道,載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠中采用TMAO的斑塊總面積增加了2倍[4]。上述研究提示降低TMAO水平可能是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的有效方法。然而,TMAO在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性中的作用及機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)評(píng)估ST段抬高性心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)病人的斑塊形態(tài),分析血漿TMAO水平與OCT檢測(cè)到的易損斑塊之間的關(guān)系,同時(shí)探討了觸發(fā)TMAO形成的黃素單加氧酶3抑制劑甲巰咪唑(methimazole,MMI)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔模型斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2021年2月205例接受OCT評(píng)估罪犯病變的STEMI病人。納入標(biāo)準(zhǔn)：STEMI病人;年齡≥18歲;病人簽署書面知情同意書。205例病人中,49例被排除,其中支架內(nèi)血栓形成14例,大量血栓8例,圖像質(zhì)量差20例和其他病因7例。將156例病人分為易損組(54例)和非易損組(102例)。STEMI定義為持續(xù)性胸痛>30 min,ST段抬高>0.1 mV,至少兩個(gè)相鄰導(dǎo)聯(lián)或18導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)出現(xiàn)新的左束支傳導(dǎo)阻滯,肌鈣蛋白I水平升高。罪犯病變由心臟病專家和影像技術(shù)人員通過(guò)心電圖、超聲心動(dòng)圖、血管造影和OCT進(jìn)行鑒定。

1.2 OCT圖像分析 OCT圖像由2名研究員在St Jude OCT離線審查工作站中分析,出現(xiàn)不一致結(jié)果時(shí)采用共同協(xié)商解決。易損和非易損斑塊的觀察者內(nèi)Kappa系數(shù)分別為0.962和0.951,觀察者間Kappa系數(shù)為0.813。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5],非易損斑塊是通過(guò)破壞的纖維帽和清晰的空腔形成。易損斑塊定義為罪犯病變處的斑塊至少有一個(gè)不同光信號(hào)強(qiáng)度的異質(zhì)信號(hào)豐富層位于管腔表面附近,并與下面的組織清楚區(qū)分,詳見(jiàn)圖1。圖中白色箭頭表示血栓。

圖1 典型OCT圖像

1.3 測(cè)定血漿TMAO水平 肝素化前,通過(guò)橈骨或股骨通路采集血樣,收集于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的真空采集試管。樣品置于-80 ℃環(huán)境中,進(jìn)一步分析。采用穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量血漿TMAO水平。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的24只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)新西蘭雄性大白兔(8周齡)隨機(jī)分為正常組(對(duì)照組)、動(dòng)脈粥樣硬化組(模型組)和動(dòng)脈粥樣硬化+MMI治療組(干預(yù)組),每組8只家兔。對(duì)照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)兔飼料,模型組和干預(yù)組飼喂高膽固醇高脂飼料(1%膽固醇、4%豬油、15%蛋黃粉)。喂養(yǎng)第13周,干預(yù)組家兔給予MMI灌胃給藥(批號(hào)：HY-B0208,美國(guó)MedChemExpress公司),劑量為15 mg/kg,每日1次,連續(xù)給藥4周。模型組家兔注射等量生理鹽水。飼養(yǎng)過(guò)程中,每4周記錄一次家兔體質(zhì)量和血漿TMAO水平。第16周結(jié)束,所有家兔全身注射肝素抗凝,之后采用戊巴比妥鈉處死。取出主動(dòng)脈組織進(jìn)行病理分析。

1.5 組織學(xué)分析 將主動(dòng)脈組織置于4%多聚甲醛中固定24 h,蔗糖脫水后包埋于最佳切割溫度(OCT)復(fù)合物中,連續(xù)冰凍切片厚7 μm。將冰凍切片用油紅O(美國(guó)Sigma)、蘇木精-伊紅(HE)(美國(guó)Sigma)和Masson三色染色(北京Solarbio公司)染色觀察斑塊病變。選擇覆蓋壞死核心的連續(xù)纖維帽切片,繪制垂直于管腔的線測(cè)量纖維帽厚度。每個(gè)斑塊隨機(jī)選擇3個(gè)位置測(cè)量纖維帽厚度和內(nèi)膜-中層厚度,取平均值。內(nèi)膜/中層比值為內(nèi)膜面積(內(nèi)部彈性層面積減去管腔面積)與中層面積(內(nèi)部和外部彈性層之間的面積)比值。為了對(duì)主動(dòng)脈區(qū)域的總粥樣硬化斑塊進(jìn)行正面分析,每個(gè)主動(dòng)脈沿著縱軸展開,之后固定在黑色背景板上。主動(dòng)脈采用油紅O染色,并使用高分辨率相機(jī)拍攝。

1.6 免疫印跡法(Western Blot)分析 模型組和干預(yù)組取斑塊顯著的組織進(jìn)行檢查。將100 mg組織加入1 mL RIPA裂解緩沖液中進(jìn)行組織均質(zhì)化以提取總組織蛋白。將等量的蛋白質(zhì)加載到十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上進(jìn)行分離,并將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(美國(guó)Millipore公司)。使用5%脫脂奶粉封閉后,在膜上依次加入相應(yīng)的一級(jí)抗體和二級(jí)抗體。本實(shí)驗(yàn)使用以下抗體：抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR,1∶500,美國(guó)Santa Cruz公司),抗磷酸化mTOR(p-mTOR)(1∶500,Santa Cruz),抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K,1∶1 000,美國(guó)Proteintech公司),抗磷酸化PI3K(p-PI3K)(1∶1 000,Proteintech),蛋白激酶B(Akt,1∶1 000,Proteintech),抗磷酸化Akt(p-Akt)(1∶1 000,Proteintech)和抗GAPDH(1∶2 000,Santa Cruz)。二級(jí)抗體為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Servicebio公司)。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示條帶,Bio-Rad成像儀曝光和掃描。利用Quantity-One軟件對(duì)免疫反應(yīng)條帶進(jìn)行定量分析,并以GAPDH作為內(nèi)參測(cè)定靶蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 病人臨床資料 納入病人的平均年齡57歲,男性占81.4%,高血壓病人占55.1%,糖尿病病人占30.1%。易損組較非易損組年齡更大,體質(zhì)指數(shù)更低,易損組斑塊破裂和薄纖維帽粥樣硬化斑塊發(fā)生率高于非易損組(P<0.01)。易損組血漿TMAO水平高于非易損組(P<0.001),且纖維帽厚度降低(P<0.001)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,TMAO與纖維帽厚度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.418,P<0.001),詳見(jiàn)圖2。

表1 易損組和非易損組臨床資料比較

(續(xù)表)

圖2 TMAO和纖維帽厚度的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.2 家兔的基本特征及血漿TMAO水平變化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)照組家兔一般情況良好,模型組和干預(yù)組家兔表現(xiàn)出食欲差、無(wú)精打采、毛發(fā)稀疏、行動(dòng)遲緩等輕微癥狀。3組體質(zhì)量繼續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)。高脂飼料喂養(yǎng)8～12周,模型組和干預(yù)組體質(zhì)量增加均大于對(duì)照組,12周時(shí)差異顯著,詳見(jiàn)圖3A。與對(duì)照組比較,4周時(shí)、8周時(shí)、12周時(shí)和16周時(shí)模型組血漿TMAO水平升高(P<0.05);16周時(shí)干預(yù)組血漿TMAO水平低于模型組(P<0.001)。詳見(jiàn)圖3B。

模型組與對(duì)照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001;干預(yù)組與模型組比較,#P<0.001。圖3 各組家兔體質(zhì)量和血漿TMAO水平變化(A為各組體質(zhì)量折線圖;B為各組血漿TMAO水平變化)

2.3 主動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊易損性情況 為進(jìn)一步定量比較動(dòng)脈粥樣硬化病變,對(duì)3組家兔的主動(dòng)脈進(jìn)行病理染色分析。與對(duì)照組比較,模型組主動(dòng)脈出現(xiàn)更多的紅色脂質(zhì)斑塊,干預(yù)組顯著降低了脂質(zhì)斑塊的比例,詳見(jiàn)圖4A。HE染色顯示：對(duì)照組主動(dòng)脈血管形態(tài)正常,模型組動(dòng)脈管腔明顯變窄,動(dòng)脈內(nèi)膜增厚,內(nèi)膜下可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞,中層平滑肌細(xì)胞排列紊亂,詳見(jiàn)圖4B。Masson染色顯示：模型組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面覆蓋著弱纖維帽,甚至部分?jǐn)嗔?對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)彈力膜連續(xù)和完整,但模型組中由于大量脂質(zhì)侵入而嚴(yán)重受損,并在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊下破裂成碎片;干預(yù)組可減少脂質(zhì)浸潤(rùn),改善內(nèi)膜完整性,詳見(jiàn)圖4C。干預(yù)組可減輕主動(dòng)脈內(nèi)膜增生,降低內(nèi)膜-中層厚度和內(nèi)膜/中層比值,同時(shí)增加斑塊纖維帽厚度,詳見(jiàn)圖4D～圖4F。

與模型組比較,＊P<0.01。圖4 各組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織學(xué)特征和病理變化(A為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主動(dòng)脈胸腹段縱剖面的油紅O染色圖;B為主動(dòng)脈HE染色圖;C為主動(dòng)脈Masson染色圖;D為模型組與干預(yù)組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚度比較的柱狀圖;E為模型組與干預(yù)組內(nèi)膜-中層厚度比較的柱狀圖;F為模型組與干預(yù)組內(nèi)膜/中層比值比較的柱狀圖)

2.4 MMI對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響 模型組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.001);干預(yù)組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)低于模型組(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)圖5。

模型組與對(duì)照組比較,＊P<0.001;干預(yù)組與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖5 MMI對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響(A為PI3K/Akt/mTOR信號(hào)分子蛋白條帶圖;B為PI3K/Akt/mTOR信號(hào)分子蛋白柱狀圖)

3 討 論

易損斑塊的形成通過(guò)將冠狀動(dòng)脈管腔逐漸狹窄缺血促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展[6]。一項(xiàng)病理研究表明,復(fù)發(fā)性斑塊破裂或侵蝕后愈合可能促進(jìn)斑塊生長(zhǎng)和增加負(fù)擔(dān)[7]。與非易損斑塊的病人比較,罪犯部位易損斑塊的病人管腔狹窄程度更高,病變更長(zhǎng)、更復(fù)雜[8]。本研究納入的34.6%STEMI病人罪犯斑塊中發(fā)現(xiàn)了易損斑塊,且易損斑塊病人存在較多的斑塊破裂和薄纖維帽粥樣硬化斑塊,增加了心血管事件風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示,易損斑塊病人血漿TMAO水平高于非易損斑塊病人;相關(guān)性分析顯示,TMAO與纖維帽厚度呈負(fù)相關(guān)。TMAO是膳食中膽堿和磷脂酰膽堿依賴腸道微生物群的副產(chǎn)物,來(lái)源于黃素單加氧酶3對(duì)三甲胺的氧化[9]。含三甲胺的營(yíng)養(yǎng)素廣泛存在于日常生活食物中,包括紅肉、蛋黃和海鮮。TMAO可增強(qiáng)血小板反應(yīng)性,減少膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn),增加巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞活化,并與冠狀動(dòng)脈疾病的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[10]。因此,TMAO可能參與STEMI病人罪犯病變斑塊破裂。

為了進(jìn)一步評(píng)估TMAO在斑塊穩(wěn)定性中的作用,采用新西蘭家兔模擬動(dòng)脈粥樣硬化,由于家兔與人類病理學(xué)之間有較強(qiáng)的相似性;家兔對(duì)高膽固醇飲食敏感,高膽固醇飲食可導(dǎo)致顯著的主動(dòng)脈粥樣硬化表型[11]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組主動(dòng)脈出現(xiàn)更多的紅色脂質(zhì)斑塊,動(dòng)脈管腔變窄,動(dòng)脈內(nèi)膜增厚,并在內(nèi)膜下可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞,中層平滑肌細(xì)胞排列紊亂。Masson染色顯示,模型組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面覆蓋著弱纖維帽,甚至部分?jǐn)嗔选＿@些發(fā)現(xiàn)提示新西蘭家兔成功模擬了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損模型。同時(shí)結(jié)果顯示,模型組各時(shí)間血漿TMAO水平高于對(duì)照組;采用MMI降低血漿TMAO水平有助于減輕家兔主動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈內(nèi)膜增生,降低內(nèi)膜-中層厚度和內(nèi)膜/中層比值,同時(shí)增加斑塊纖維帽厚度。結(jié)果表明,降低血漿TMAO水平減輕了高脂喂養(yǎng)引起的兔動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,并一定程度降低了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性。

目前,PI3K/Akt/mTOR通路認(rèn)為是調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)鍵通路,多項(xiàng)研究表明,抑制PI3K/Akt/mTOR通路能有效改善動(dòng)脈粥樣硬化[12-13]。有研究顯示,miR-126通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路恢復(fù)自噬通量,減輕低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13]。相關(guān)研究顯示,PI3K/Akt/mTOR通路是血管生成的關(guān)鍵通路,其下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶細(xì)胞因子通過(guò)誘導(dǎo)血管生成,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展[14-15]。本研究結(jié)果顯示,模型組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)顯著高于對(duì)照組,表明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中被激活。采用MMI處理后這些蛋白水平均降低,提示TMAO可能通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與斑塊形成。

綜上所述,TMAO在AMI病人罪犯病變斑塊破裂中發(fā)揮著重要作用。STEMI病人和兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血漿TMAO水平增加,可能通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR通路促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展和斑塊易損,抑制血漿TMAO水平可能是預(yù)防AMI的一種新策略。