醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯減輕肢體缺血再灌注致心肌損傷的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

郭 悅,劉純興

肢體缺血再灌注是臨床常見的病理損傷類型,肢體局部組織缺血后易發(fā)生再灌注損傷,并損傷其他遠(yuǎn)端器官[1]。其中心肌組織是缺血再灌注損傷的敏感器官,主要是在肢體再灌注損傷過程中釋放大量的活性氧或炎性因子,并在心肌組織聚集大量中性粒細(xì)胞,導(dǎo)致心肌損傷[2]。醛固酮是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶合成并分泌的一種類固醇激素,具有調(diào)節(jié)水鹽代謝及改善血壓的功效,在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3]。因此,醛固酮可能是心肌缺血再灌注損傷過程中的主要病理因素,采用醛固酮受體拮抗劑可有效拮抗醛固酮釋放,并抑制炎性介質(zhì)、黏附因子釋放,減少心肌細(xì)胞凋亡,緩解心肌炎癥狀。螺內(nèi)酯在肢體缺血再灌注致心肌損傷中的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過建立肢體缺血再灌注模型,分析醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯對(duì)肢體缺血再灌注致心肌損傷的作用,探討其作用信號(hào)通路,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 30只健康Wistar雄性大鼠,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,8月齡,體質(zhì)量210～260 g;常規(guī)條件下正常飼養(yǎng)。螺內(nèi)酯購自江蘇宜興前進(jìn)制藥廠;Nikon攝影生物光學(xué)顯微鏡(日本日立公司)、DF-205恒溫干燥箱(北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠)。

1.2 制備動(dòng)物模型 將30只健康Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只,正常飼養(yǎng))、再灌注組(10只,建立肢體缺血再灌注大鼠模型)、螺內(nèi)酯組(10只,建立模型前給予螺內(nèi)酯)。利用橡皮圈環(huán)繞大鼠雙后肢根部并進(jìn)行結(jié)扎,阻斷4 h,之后松解橡皮圈,再恢復(fù)血流灌注4 h。松解橡皮圈15 min前,腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)進(jìn)行麻醉,于左側(cè)頸外置管注射肝素后進(jìn)行抗凝血。對(duì)照組雙后肢用橡皮圈松弛環(huán)繞未阻斷血流,4 h后取下橡皮圈,并恢復(fù)血流4 h。血流恢復(fù)后麻醉并處死大鼠。螺內(nèi)酯組大鼠建立模型前,連續(xù)6 d進(jìn)行螺內(nèi)酯灌胃,每次20 mg/kg,6 d后成功建立動(dòng)物模型并處死。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心肌組織形態(tài) 麻醉處死大鼠后,留取心肌組織,石蠟包埋,組織切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡數(shù),細(xì)胞核為棕褐色或?yàn)樽攸S色,伴有凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)。隨機(jī)選擇5個(gè)視野,每個(gè)視野極端陽性細(xì)胞占全部心肌細(xì)胞的百分比,計(jì)算凋亡百分比。

1.3.2 血清炎性因子 麻醉處死3組大鼠后留取血漿約6 mL及心肌組織,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-6、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá),試劑盒由武漢優(yōu)爾生物科技股份公司提供。

1.3.3 血清心肌酶表達(dá) 采用全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI7200型)檢測(cè)肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)表達(dá)。

1.3.4 心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 留取心肌組織,加入冷生理鹽水制備為10%組織勻漿,離心10 min,以3 000 r/min,收集上清液,采用放射免疫法檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.5 相關(guān)基因表達(dá) 采用免疫組化法測(cè)定心肌組織HMGB1 mRNA表達(dá)、Toll樣受體4(TLR4) mRNA表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 3組心肌組織形態(tài)學(xué)變化及心肌細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組心肌纖維排列整齊,細(xì)胞核均勻一致,心肌細(xì)胞紋理清楚;再灌注組心肌細(xì)胞腫脹、變性,細(xì)胞質(zhì)紅染,細(xì)胞核數(shù)量明顯減少,心肌纖維壞死斷裂,間隙增加,周圍組織存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性物質(zhì)滲出。螺內(nèi)酯組心肌纖維排列較再灌注組整齊,間隙寬度縮小,心肌細(xì)胞呈輕微腫脹。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率為(5.28±1.05)%,再灌注組為(185.47±35.85)%,螺內(nèi)酯組為(75.25±24.19)%,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.575,P<0.001)。

2.2 3組大鼠血清心肌酶表達(dá)比較 再灌注組、螺內(nèi)酯組血清cTnI、CK、CK-MB表達(dá)較對(duì)照組增加;螺內(nèi)酯組血清cTnI、CK、CK-MB表達(dá)低于再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠血清心肌酶表達(dá)比較(±s)

2.3 3組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 再灌注組、螺內(nèi)酯組心肌組織內(nèi)MDA表達(dá)較對(duì)照組升高,SOD、GSH-PX含量較對(duì)照組降低;螺內(nèi)酯組心肌組織內(nèi)MDA表達(dá)低于再灌注組,SOD、GSH-PX含量高于再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較(±s)

2.4 3組大鼠心肌與血漿IL-6、HMGB1表達(dá)比較 再灌注組、螺內(nèi)酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1表達(dá)均高于對(duì)照組;螺內(nèi)酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1表達(dá)均低于再灌注組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組大鼠心肌與血漿IL-6、HMGB1表達(dá)比較(±s)

2.5 3組大鼠心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)比較 再灌注組、螺內(nèi)酯組心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組;螺內(nèi)酯組心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)低于再灌注組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 3組大鼠心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

肢體缺血再灌注損傷的病理過程復(fù)雜,通常再灌注損傷后釋放大量氧自由基及炎性物質(zhì),導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡,造成除了肢體以外遠(yuǎn)隔器官損傷[4]。心肌組織是肢體缺血再灌注損傷后主要累及的敏感器官,可能是體內(nèi)釋放的大量氧自由基、炎性因子經(jīng)血液循環(huán)到心肌組織,導(dǎo)致心肌組織損傷及心肌功能降低[5-6]。本研究建立肢體缺血再灌注損傷大鼠模型后心肌細(xì)胞腫脹、變性,細(xì)胞質(zhì)紅染,細(xì)胞核數(shù)量減少,心肌纖維壞死斷裂,間隙增加,周圍組織存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性物質(zhì)滲出。說明肢體缺血再灌注損傷易誘發(fā)心肌損傷。螺內(nèi)酯組心肌細(xì)胞凋亡率為(75.25±24.19)%,低于再灌注組的(185.47±35.85)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此,采用螺內(nèi)酯提前給藥處理,可減輕心肌損傷,減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量。本研究結(jié)果也顯示,螺內(nèi)酯組血清cTnI、CK、CK-MB表達(dá)低于再灌注組(P<0.05)。結(jié)果證實(shí)螺內(nèi)酯可減輕心肌損傷。

脂質(zhì)過氧化是心肌細(xì)胞損傷的重要因子,其中MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物,其表達(dá)與脂質(zhì)過氧化程度密切相關(guān),可反映氧自由基水平[7];SOD、GSH-PX是機(jī)體防御自由基損傷的重要系統(tǒng),是清除氧自由基表達(dá)、減輕組織器官損傷的重要因子[8]。本研究結(jié)果顯示,再灌注組,螺內(nèi)酯組心肌組織內(nèi)MDA表達(dá)較對(duì)照組升高,SOD、GSH-PX含量較對(duì)照組降低;螺內(nèi)酯組心肌組織內(nèi)MDA表達(dá)低于再灌注組,SOD、GSH-PX含量高于再灌注組(P<0.05)。表明肢體缺血再灌注后處于強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激狀態(tài),采用螺內(nèi)酯治療可減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度。由于肢體缺血再灌注后抗氧化酶含量及自由基清除酶系統(tǒng)活性降低,脂質(zhì)過氧化系統(tǒng)激活,導(dǎo)致心肌組織處于高度的氧化應(yīng)激狀態(tài)[9-10]。炎癥反應(yīng)方面,再灌注組、螺內(nèi)酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1表達(dá)及心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組;螺內(nèi)酯組心肌與血漿IL-6、HMGB1及心肌HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)均低于再灌注組(P<0.05)。提示肢體缺血再灌注后處于強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)狀態(tài),導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。

分析具體的作用機(jī)制：螺內(nèi)酯通過結(jié)合心肌細(xì)胞膜上受體,激活磷脂酶C,以此升高細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度,迅速激活蛋白激酶C,降低線粒體膜通透性,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕心肌細(xì)胞損傷[11-12];螺內(nèi)酯抑制心肌細(xì)胞凋亡,延緩心肌細(xì)胞死亡,抑制心肌重構(gòu),以此延緩心肌損傷過程[13]。其作用信號(hào)傳導(dǎo)主要是抑制HMGB1-TLR4信號(hào)通道,TLR4表達(dá)在心血管系統(tǒng)中升高,TLR4激活后可正向調(diào)控炎癥信號(hào)通路,導(dǎo)致血管重構(gòu)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及心肌細(xì)胞凋亡,與心肌缺血再灌注損傷、心肌炎等多種疾病關(guān)系密切[14]。HMGB1是一種核蛋白,廣泛存在于所有細(xì)胞內(nèi),是TLR4的重要配體,釋放后與TLR4結(jié)合,促進(jìn)體內(nèi)固有免疫信號(hào)通路的活性,釋放大量炎性因子,導(dǎo)致組織或器官損傷[15]。螺內(nèi)酯通過下調(diào)HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá),抑制炎癥反應(yīng),并拮抗醛固酮作用,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述,肢體缺血再灌注后常導(dǎo)致心肌損傷,采用螺內(nèi)酯治療可減輕心肌損傷程度,可能是通過抑制氧化反應(yīng)、抗炎癥反應(yīng)減輕心肌損傷程度,其作用信號(hào)傳導(dǎo)通路主要是抑制HMGB1-TLR4信號(hào)通道及炎癥反應(yīng),發(fā)揮緩解心肌損傷的作用,但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。