蹇 強(qiáng),李 丹,程 瑋,孫 敏
心肌炎是心臟炎癥性疾病,也是擴(kuò)張型心肌病的前兆,通常以細(xì)胞浸潤為主要特征,若心肌炎癥在急性期未消退,心臟可能由于心肌細(xì)胞壞死受到直接損害,肉芽腫性炎癥引起的損傷或成纖維細(xì)胞的增殖和膠原沉積引起的纖維化,可能導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病或充血性心力衰竭發(fā)生[1-2]。心肌炎病因包括感染性和非感染性,其中病毒感染是心肌炎的常見病因,病毒可能在遺傳易感個體中誘發(fā)心肌炎,兒童更易患心肌炎,目前,引起病毒性心肌炎的病毒主要包括柯薩奇病毒B、人類免疫缺陷病毒1、流感病毒及甲型和丙型肝炎病毒等[3]。盡管在較多研究中應(yīng)用了包括皮質(zhì)類固醇在內(nèi)的免疫抑制藥物治療病毒性心肌炎,但效果存在爭議。
近年來,越來越多的實驗和臨床研究為應(yīng)用細(xì)胞移植改善心肌功能的策略提供支持。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有抗凋亡、抗纖維化和促血管生成等作用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,HuMSCs)是從臍帶動脈和靜脈及內(nèi)皮下、血管周圍區(qū)域中分離出來的細(xì)胞,較其他干細(xì)胞的來源豐富,生物學(xué)性狀穩(wěn)定,具有低免疫原性等特點[4-5]。已有研究表明,HuMSCs移植可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2信號傳導(dǎo)途徑和抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕急性心肌炎大鼠的心肌損傷和心臟功能障礙[6]。胰島再生源蛋白Ⅲγ(islet regenerating Ⅲγ,RegⅢγ)是一種免疫炎癥調(diào)節(jié)因子,在多種疾病或受損組織中表達(dá),通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抵抗細(xì)胞凋亡,發(fā)揮修復(fù)組織損傷的功能[7]。本研究通過慢病毒介導(dǎo)RegⅢγ感染HuMSCs,得到RegⅢγ修飾的HuMSCs,觀察其對柯薩奇B3病毒(CVB3)誘導(dǎo)的心肌炎小鼠模型心臟功能及損傷的影響,以期為臨床治療提供實驗依據(jù)。
1.1 實驗動物 健康無特定病原體(SPF)級雄性BALB/C小鼠40只,4周齡,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供,飼養(yǎng)于無特定病原體屏障環(huán)境,溫度為22~24 ℃,相對濕度為(50±5)%,12 h/12 h明暗周期交替。本研究獲得我院倫理委員會審批。
1.2 實驗試劑 RegⅢγ重組表達(dá)載體(PCDH-CMV-GFP-RegⅢγ)的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染細(xì)胞及慢病毒包裝過程均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。胎牛血清(杭州四季青),DMEM/F12培養(yǎng)液和胰蛋白酶(美國HyClone公司),Trizol試劑盒(美國Thermo公司),Sensi Fast c-DNA 合成試劑盒和SensiFast SYBR Green Hi-ROX試劑盒(英國Bioline公司),酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司),蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),免疫組織化學(xué)染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司),抗體CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、人類白細(xì)胞抗原-DR蛋白(HLA-DR)、CD4、CD8及CD68(英國Abcam公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠(武漢博士德生物工程有限公司)。
1.3 實驗方法
1.3.1 HuMSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定 收集我院婦產(chǎn)科無菌健康新生兒的臍帶組織,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌干凈,剪成約1 mm3的組織塊,加入膠原酶Ⅱ消化,篩網(wǎng)過濾,濾液以4 000 r/min離心10 min,棄上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫箱培養(yǎng),3~5 d后換液,棄未貼壁細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng),每隔2 d換液1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞,融合度達(dá)80%后胰酶消化,擴(kuò)大培養(yǎng)。選擇第3代細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD73、CD90及HLA-DR的表達(dá)。
1.3.2 慢病毒感染HuMSCs 將HuMSCs消化后,按照每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于24孔板,放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫箱內(nèi),待生長至融合度達(dá)到80%時,在培養(yǎng)孔內(nèi)加入含有過表達(dá)RegⅢγ的慢病毒懸液的培養(yǎng)液,混勻后,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱,根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài),12~16 h更換培養(yǎng)液,感染24 h和48 h后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。
1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)實驗 在感染后的HuMSCs中加入Trizol試劑液,按說明步驟提取總RNA,經(jīng)分光光度計檢測純度與濃度后,根據(jù)Sensi Fast c-DNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以獲得的cDNA為模板,經(jīng)過Rotor GeneQ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,檢測RegⅢγ mRNA的表達(dá)水平,具體操作按照SensiFast SYBR Green Hi-ROX試劑盒說明書進(jìn)行,以β-actin作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件:95 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 10 s,共40個循環(huán)。RegⅢγ和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列:RegⅢγ正向引物5′-AAGGTTGATTCTTTCAGGGAGC-3′,反向引物5′-AGTGGATCTGAGTTAGGTCATGG-3′;β-actin正向引物5′-TGCGTGACATGAGAAG-3′,反向引物5′-GCTCGTAGCTTCTCCA-3′。使用2-ΔΔCt法計算目的基因表達(dá)量。
1.3.4 動物建模與分組處理 將40只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組,每組10只。模型組、HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組均采用腹腔內(nèi)注射200 μL含102半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的CVB3病毒液建立心肌炎模型[8],對照組注射等量生理鹽水。次日,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組小鼠分別尾靜脈注射100 μL的HuMSCs、RegⅢγ-HuMSCs,注射細(xì)胞數(shù)量均為1×106個,對照組和模型組小鼠均尾靜脈注射100 μL的生理鹽水。
1.3.5 心臟超聲檢查 14 d后,采用異氟烷麻醉4組小鼠,固定在手術(shù)臺上,應(yīng)用高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng),采集并記錄小鼠超聲相關(guān)指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)、縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening,FS)、左室舒張末期容積(end-diastolic volume,LVEDV)和左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV),通過系統(tǒng)軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)。
1.3.6 ELISA實驗 心臟超聲檢查完畢后,4組小鼠摘眼球取血,血液室溫靜置1h后,4℃條件下,以4 000 r/min離心10 min,取血清,根據(jù)試劑盒說明書操作,ELISA法檢測各組血清白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-23含量。
1.3.7 HE染色 處死4組小鼠,解剖取其心肌組織,清洗干凈后,采用4%多聚甲醛室溫固定過夜。次日,梯度乙醇對心肌組織進(jìn)行脫水,二甲苯透明,蠟塊包埋,制作厚度約為4 μm的石蠟切片,采用HE染色對心肌組織石蠟切片進(jìn)行染色,切片進(jìn)行脫蠟水化后,加入蘇木素染色5 min,流水沖洗干凈,再用伊紅染液復(fù)染3 min,脫水、透明后,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下攝影并觀察組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化情況。
1.3.8 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)染色 取制備的小鼠心肌組織石蠟切片,脫蠟水化后,將蛋白酶K與緩沖液混合進(jìn)行稀釋,使用100 μL的蛋白酶K工作液(20 μg/mL),37 ℃條件下孵育10 min,PBS漂洗干凈,封閉液處理10 min,50 μL TUNEL試劑液孵育1 h。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明后,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下攝影并觀察,隨機(jī)選擇5個視野,陽性染色為棕褐色,代表凋亡細(xì)胞,計數(shù)視野下陽性細(xì)胞與總細(xì)胞,以兩者比值作為TUNEL陽性率。
1.3.9 免疫組織化學(xué)染色 將制備的4組小鼠石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化,置于檸檬酸鹽液浸泡,進(jìn)行高溫修復(fù)抗原。3%過氧化氫溶液孵育10 min后,將切片用5%山羊血清室溫封閉30 min。加入一抗T淋巴細(xì)胞表面抗原(CD4、CD8)和巨噬細(xì)胞特異性抗體(CD68)工作液,放于4 ℃下孵育過夜。次日,棄去一抗液,加入對應(yīng)二抗工作液,室溫繼續(xù)孵育60 min。利用DAB法染色,蘇木精復(fù)染5 min,分化數(shù)秒,自來水沖洗干凈,脫水、透明后,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下對免疫組織化學(xué)切片攝影,陽性染色呈棕色至棕褐色,應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色區(qū)域的平均吸光度值。
2.1 HuMSCs的鑒定結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的細(xì)胞,第7天可見細(xì)胞較少,且聚集成團(tuán);第14天細(xì)胞明顯增多,形狀為典型的紡錘形。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞表面抗原CD44、CD73和CD90表達(dá)水平均較高,CD34、CD45及HLA-DR表達(dá)均較低。詳見圖1。說明成功分離到HuMSCs。
2.2 慢病毒感染HuMSCs效果測定 轉(zhuǎn)染24 h、48 h后,倒置熒光顯微鏡觀察到經(jīng)過慢病毒感染的HuMSCs中均可見綠色熒光蛋白表達(dá),48 h時表達(dá)明顯,感染率達(dá)到98.4%。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,感染含RegⅢγ的RegⅢγ-HuMSCs組細(xì)胞中RegⅢγ mRNA表達(dá)水平高于未感染的對照組細(xì)胞(P<0.05)。詳見圖2。此結(jié)果說明已獲得RegⅢγ修飾的HuMSCs。
2.3 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心功能的影響 與對照組比較,模型組小鼠EF、FS降低,LVEDV、LVESV升高(P<0.05);與模型組比較,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組EF、FS均升高,LVEDV、LVESV均降低(P<0.05);與HuMSCs組比較,RegⅢγ-HuMSCs組EF和FS均升高,LVEDV和LVESV均降低(P<0.05)。詳見圖3、表1。
圖1 HuMSCs鑒定(A為倒置顯微鏡觀察HuMSCs形態(tài);B為流式細(xì)胞術(shù)檢測HuMSCs表面抗原表達(dá))
與HuMSCs組比較,*P<0.05。圖2 HuMSCs感染(A為倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá);B為qRT-PCR檢測細(xì)胞RegⅢγ mRNA表達(dá)水平)
圖3 各組小鼠心臟超聲圖像
表1 各組小鼠心功能指標(biāo)EF、FS、LVEDV及LVESV比較(±s)
2.4 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠血清IL-2、IL-6和IL-23含量增加,IL-4和IL-10含量減少(P<0.05);與模型組比較,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組血清IL-2、IL-6和IL-23含量減少,IL-4和IL-10含量增加(P<0.05);與HuMSCs組比較,RegⅢγ-HuMSCs組血清IL-2、IL-6和IL-23含量減少,IL-4和IL-10含量增加(P<0.05)。詳見表2。
表2 各組小鼠血清炎性因子水平比較(±s) 單位:pg/mL
2.5 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心肌組織病理損傷的影響 HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠心肌組織內(nèi)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊,無炎性細(xì)胞浸潤;模型組心肌組織內(nèi)細(xì)胞排列紊亂,炎性細(xì)胞浸潤明顯,有壞死灶,且有部分血管滲出蛋白黏液;HuMSCs組心肌組織仍有炎性細(xì)胞浸潤,但病理損傷較模型組減輕;RegⅢγ-HuMSCs組心肌組織內(nèi)細(xì)胞排列較為整齊,結(jié)構(gòu)清晰,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。詳見圖4。
圖4 HE染色檢測各組小鼠心肌組織病理損傷(200 μm)
2.6 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示,對照組小鼠心肌組織內(nèi)棕褐色細(xì)胞染色減少;相較于對照組,模型組小鼠心肌組織內(nèi)有大量棕褐色細(xì)胞,TUNEL陽性率高于對照組(P<0.05);與模型組比較,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組心肌組織棕褐色細(xì)胞減少,TUNEL陽性率降低(P<0.05);RegⅢγ-HuMSCs組TUNEL陽性率低于HuMSCs組(P<0.05)。詳見圖5、圖6。
圖5 TUNEL染色檢測各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡(50 μm)
模型組與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;RegⅢγ-HuMSCs組與HuMSCs組比較,△P<0.05。圖6 TUNEL染色檢測各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡比較
2.7 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心肌組織CD4、CD8、CD68表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,模型組小鼠心肌組織內(nèi)CD4、CD8及CD68蛋白均呈強(qiáng)陽性表達(dá),可見明顯的棕褐色染色,CD4、CD8、CD68蛋白表達(dá)均高于對照組(P<0.05);HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組心肌組織內(nèi)棕褐色染色強(qiáng)度較模型組減少,CD4、CD8及CD68蛋白表達(dá)降低(P<0.05);RegⅢγ-HuMSCs組CD4、CD8及CD68蛋白表達(dá)較HuMSCs組下降(P<0.05)。詳見圖7、圖8。
圖7 免疫組織化學(xué)染色檢測心肌組織CD4、CD8、CD68表達(dá)(200 μm)
模型組與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;RegⅢγ-HuMSCs組與HuMSCs組比較,△P<0.05。圖8 免疫組織化學(xué)染色檢測心肌組織CD4、CD8、CD68表達(dá)比較
心肌炎是炎性細(xì)胞浸潤到心肌組織,導(dǎo)致心臟功能惡化的風(fēng)險增加,且臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性。心肌炎主要由病毒感染介導(dǎo),也可由細(xì)菌、原生動物或真菌感染、多種有毒物質(zhì)和藥物及全身免疫介導(dǎo)的疾病所誘發(fā)。盡管目前進(jìn)行了廣泛研究,但并發(fā)左心室功能障礙、心力衰竭或心律失常的心肌炎,常出現(xiàn)危及生命的癥狀,包括惡性心律失常、心源性休克及猝死等[2,9]。由于心肌炎臨床表現(xiàn)具有多樣性和病因復(fù)雜性,需結(jié)合具體情況制定治療方案,即對癥支持治療,在此基礎(chǔ)上,包括主動脈內(nèi)球囊反搏、體外膜肺氧合及心室輔助裝置等在內(nèi)的器械支持也是常用的治療方法[10]。近年來,免疫抑制和抗病毒治療在心肌炎的研究中得以運(yùn)用,但這些方法的療效均不理想。減輕心肌炎的炎癥反應(yīng)和抑制心肌細(xì)胞凋亡對提高心臟功能具有積極的意義。
HuMSCs除了具有自我更新能力外,同時表現(xiàn)出較小的免疫排斥反應(yīng),可用于同種異體移植,這些特征表明HUMSCs治療自身免疫性疾病及修復(fù)組織損傷的潛力,并已得到證實。HUMSCs通過芳烴受體(AhR)調(diào)節(jié)宿主免疫和腸道微生物群之間的相互作用,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠中發(fā)揮治療作用[11];HuMSCs調(diào)節(jié)通過轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad家族成員3(TGF-β1/Smad3)信號途徑參與抑制卵巢組織的纖維化,修復(fù)原發(fā)性卵巢功能不全大鼠的卵巢功能[12];鼻腔移植細(xì)胞球蛋白(CYGB)修飾HuMSCs后,通過蛋白38型絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡改善新生大鼠缺氧缺血性腦損傷[13]。本研究超聲心動圖分析結(jié)果表明,經(jīng)過CVB3誘導(dǎo)的小鼠EF和FS降低,LVEDV和LVESV升高,表明心肌收縮和舒張功能受損;CVB3誘導(dǎo)的小鼠中尾靜脈注射HuMSCs后,EF、FS均升高,LVEDV、LVESV均降低。經(jīng)過HuMSCs治療后的小鼠心肌組織病理損傷減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,心肌細(xì)胞凋亡受到抑制。由此說明,HuMSCs可抑制心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡,可改善心臟功能損傷。
Reg屬于C類凝集素超家族,具有多種生物調(diào)節(jié)功能,如參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)及抗菌作用等。RegⅢγ作為該家族的成員,可對損傷組織起到修復(fù)作用。有研究表明,RegⅢγ可促進(jìn)培養(yǎng)的結(jié)腸上皮細(xì)胞生長,并在成年小鼠的小腸中高表達(dá),在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中發(fā)揮組織保護(hù)作用[14]。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠中,腸道共生菌可活化RegⅢγ基因表達(dá),由此推測其參與大腸炎發(fā)生中的先天免疫[15]。RegⅢγ可加快急性肝衰竭中的肝再生[16]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過RegⅢγ修飾的HuMSCs治療心肌炎小鼠后,相較于HuMSCs治療比較,該作用引起EF和FS進(jìn)一步升高,LVEDV和LVESV進(jìn)一步降低,心肌組織病理損傷顯著改善,組織結(jié)構(gòu)清晰,且心肌細(xì)胞凋亡減少。這一結(jié)果表明,RegⅢγ修飾可促進(jìn)HuMSCs對心肌炎小鼠心功能及心肌組織損傷的改善作用。
由于心肌炎的常見原因是病毒感染、細(xì)菌感染及自身免疫性疾病,且心肌炎中常觀察到淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤,并檢測到促炎趨化因子、細(xì)胞因子等表達(dá)增加[17-18],因此,炎癥反應(yīng)是心肌炎主要病癥之一,抑制炎性因子和炎性細(xì)胞浸潤對改善心肌炎十分重要。本研究結(jié)果顯示,在CVB3誘導(dǎo)的小鼠血清促炎因子IL-2、IL-6和IL-23含量均增加,抑炎因子IL-4和IL-10含量均減少,心肌組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞表面抗原CD4、CD8和巨噬細(xì)胞特異性抗體CD68表達(dá)增強(qiáng),說明機(jī)體內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng),心肌組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。進(jìn)一步通過尾靜脈注射HuMSCs和RegⅢγ-HuMSCs治療后,血清IL-2、IL-6和IL-23含量均減少,IL-4和IL-10含量均增加,心肌組織內(nèi)CD4、CD8和CD68表達(dá)減弱。由此推測,RegⅢγ修飾的HuMSCs具有保護(hù)心肌炎小鼠心臟的作用,可能與抑制心肌炎性遞質(zhì)浸潤有關(guān)。
綜上所述,經(jīng)RegⅢγ修飾可促進(jìn)HuMSCs對CVB3誘導(dǎo)的小鼠病毒性心肌炎發(fā)揮心臟功能的保護(hù)作用,抑制血清炎癥反應(yīng)和組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤,減少心肌組織細(xì)胞凋亡,為心肌炎的研究提供了新方向和理論支持,然而具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。