葡萄籽多酚對心肌梗死大鼠NF-κB信號通路及腎功能的影響

武報佳,郭 華,邢慧敏,趙 睿,孫 波,馬 冬

心肌梗死是高發(fā)的心血管疾病,隨著人科生活壓力增加及生活習慣改變,心肌梗死發(fā)病率逐漸升高,且呈年輕化趨勢,且致死率較高,嚴重威脅人們的生命安全[1]。有研究顯示,隨著心肌梗死疾病惡化并發(fā)展為急性腎損傷的發(fā)病率升高,美國研究中心對4萬多例急性心肌梗死病人進行隨訪發(fā)現(xiàn),超過5.2%病人發(fā)生不同程度的急性腎損傷[2]。有研究證實,心肌梗死病人腎功能指標血肌酐(Cr)含量變化證實病人腎小球過濾功能存在異常[3]。核轉錄因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種具有生物調節(jié)作用的蛋白質,可介導炎癥反應、細胞生物活性及免疫應答等,其在心肌梗死生理病理中發(fā)揮著重要作用[4]。NF-κB受Rel家族及IκB家族影響,受到細胞外刺激后與IκB激酶α/β(IκKα/β)形成復合物,游離的NF-κB進入細胞核發(fā)揮靶基因調控作用。

葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)富含多種化學成分,是從葡萄籽種中提取的具有抗氧化作用的天然物質,具有無毒性、生物利用度高等優(yōu)點[5]。葡萄籽多酚可發(fā)揮抗氧化及清除自由基等作用,改善心血管疾病。朱建鴻等[6]研究表明,葡萄籽多酚對心血管合并動脈硬化、糖尿病及高血糖具有保護作用。關于心肌梗死腎功能的研究處于探討階段,本研究觀察葡萄籽多酚對心肌梗死大鼠NF-κB信號通路及腎功能的影響,為相關研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD雄雌各半大鼠50只,鼠齡6周,體質量200～300 g,許可證號：SCXK(浙)2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境：濕度為55%,溫度為25 ℃,模擬明暗交替無菌飲食2周,定時清洗、消毒鼠籠,實驗符合《實驗動物管理條例》規(guī)定管理規(guī)定。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 葡萄籽多酚(陜西錦泰生物工程有限公司,JT-10236);戊巴比妥鈉(上海行知化工廠,921019);阿托品(河南潤弘制藥股份有限公司,20150528);青霉素鈉(江西大贛農(nóng)動物藥業(yè)有限公司,140591248);NF-κB抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司,PL0403111);NF-κBp65抗體(上海恒斐生物科技有限公司,ab140751);IκKβ(上海雅吉生物科技有限公司,YS-13644R)。蘇木素染液(北京伊塔有限公司,YT8370);3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(上海雅吉有限公司,I026);實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒(美國ABI公司,7000);cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根有限公司,KR104);IP裂解液(北京百奧萊博有限公司,SY0318);二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(南京諾唯贊有限公司,E112-01)。

1.3 心肌梗死大鼠模型構建 參照相關文獻[7]建立心肌梗死大鼠模型,50只大鼠稱量體質量,清除氣管分泌物,腹腔注射60 mg/kg的阿托品、5 mg/kg的地西泮及30 mg/kg的氯胺酮麻醉,仰臥位后固定于操作臺上,暴露胸部并連接小動物呼吸機,剔除左側胸腔毛發(fā)消毒后在第4肋間與第5肋間切開皮膚,置入開胸器暴露心臟,剪開心包,于肺動脈及左側心耳距離主動脈根部0.2 cm分別用4-0線及8-0手術針結扎左冠狀動脈前降支,建立心肌梗死模型,撤離開胸器,青霉素沖洗胸腔后用2-0線縫合皮膚,大鼠清醒后撤除呼吸機。假手術組除不結扎左冠狀動脈前降支外其余同上。造模24 h后,測定A組(假手術組)和B組(心肌梗死模型組)的心電圖驗證建模是否成功,心電圖ST段抬高,提示模型構建成功。詳見圖1。

圖1 A組及B組大鼠心電圖表現(xiàn)

1.4 動物分組及干預方法 將50只大鼠按照平均體質量分為A組(假手術組)、B組(心肌梗死模型組)、C組(心肌梗死模型+低劑量葡萄籽多酚組)、D組(心肌梗死模型+高劑量葡萄籽多酚組)及E組(心肌梗死模型+血府逐瘀膠囊組),每組10只。C組和D組大鼠建模后灌胃由蒸餾水稀釋的100 mg/kg及300 mg/kg葡萄籽多酚,E組大鼠灌胃250 mg/kg的血府逐瘀膠囊。連續(xù)14 d,每日1次。A組及B組大鼠灌胃等體積生理鹽水,時間、次數(shù)同其他組。

1.5 超聲測定心臟功能 末次灌胃后采用40 mg/kg的戊巴比妥麻醉,采用多普勒超聲在二維影像指導下測定大鼠平均動脈壓(MAP)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓力(LVEDP),連續(xù)測定3次,取平均值。

1.6 腎功能檢測 末次灌胃后,采集大鼠眼眶靜脈血1.5 mL,采用低速離心機以3 000 r/min、離心半徑為10 cm運轉10 min,保留上清液,采用反比色法檢測血清Cr、尿素氮(BUN)水平。采血前24 h將大鼠分籠飼養(yǎng),收集尿液,采用黃基水楊酸-硫酸鈉比濁法檢測24 h尿蛋白(UP24),方法按照說明書進行。

1.7 組織病理學檢查 上述實驗結束后,采用頸部脫臼法處死大鼠,取大鼠心臟、1個腎臟,剔除周圍組織置入甲醛溶液中固定,組織切片后石蠟包埋,5 μm切邊,脫蠟10 min后利用95%乙醇水化,采用堿性蘇木精進行染色15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次,蒸餾水清洗,再利用0.5 mL伊紅染色3 min,PBS清洗,在200倍顯微鏡下觀察心肌及腎臟組織病理改變。

1.8 免疫印跡檢測腎臟組織NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體蛋白水平 腎臟組織加入0.125%胰蛋白裂解液,4 000 r/min離心后,在血清樣品中加入樣孔。進行電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min,反復PBS沖洗,每次5 min,分別加入NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶500)、過氧化物酶標記二抗(1∶2 000),雜交處理4 h后,沖洗,將膜浸入電化學發(fā)光(ECL)工作液,檢測獲取圖像。

1.9 qRT-PCR檢測腎臟組織NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體 mRNA 腎臟組織經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化,沖洗后置于無菌試管中,提取其RNA,75%乙醇離心,-80 ℃保存。將RNA轉化DNA,加入NF-κB抗體、NF-κBp65抗體、IκKβ抗體及NF-κB抗體,內參采用GAPDH,60 ℃預變性、10 min,95 ℃變性、72 ℃退火,各30 s、95 ℃延伸,5 min,循環(huán)次數(shù)以40次為準,采用2-ΔΔCt計算相對表達水平,引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 各組大鼠LVEDP、MAP及LVSP比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與A組比較,B組大鼠LVEDP升高,MAP及LVSP降低(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠心臟功能改善明顯(P<0.05);D組與C組大鼠心功能指標比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較(±s) 單位：mmHg

2.2 各組大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平比較 與A組比較,B組血Cr、BUN和尿UP24升高(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平降低(P<0.05);D組大鼠血Cr、BUN和尿UP24低于C組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血Cr、BUN和尿UP24水平比較(±s)

2.3 各組大鼠HE染色比較 心肌組織病理：A組大鼠心肌纖維整齊,形態(tài)橢圓形,細胞紋理清晰;B組細胞質出現(xiàn)血管水腫出血,心肌組織纖維擴張,肌絲溶解;C組、D組及E組細胞質水腫減少,間隙改善,結構接近正常。腎臟組織病理：A組腎臟組織結構完整,由腎小管和腎小球結構良好,B組腎小球間質增多,腎間質增寬,炎癥浸潤嚴重,腎小管嚴重萎縮,C組、D組及E組腎臟組織病理顯著改善,腎小球硬度降低,炎癥浸潤改善。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織及腎臟組織病理改變(HE,×200)

2.4 免疫印跡檢測各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達比較 B組大鼠腎臟組織NF-κBp65、NF-κB及IκKβ蛋白表達水平高于A組(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達水平降低(P<0.05);D組大鼠NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達水平低于C組(P<0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達比較(±s)

圖3 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ蛋白表達條帶圖

2.5 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達比較 與A組比較,B組NF-κBp65、NF-κB及IκKβ mRNA表達升高(P<0.05);C組、D組及E組NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達低于B組(P<0.05);與C組比較,D組大鼠NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達降低(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠腎臟組織NF-κB、NF-κBp65及IκKβ mRNA表達比較(±s)

3 討 論

心肌梗死是常見的心內科疾病,心肌梗死導致大量心肌細胞壞死降低心臟功能,影響病人生命安全。目前多種動物均可建立心肌梗死模型,SD大鼠具有價格便宜及適用于個體研究的優(yōu)點而被廣泛應用。心肌梗死常伴有高脂血癥,高脂血癥可損傷腎臟,加重腎小管損傷,影響腎功能。有研究表明,心肌梗死產(chǎn)生大量氧自由基,增加腎臟毒性,誘導腎上皮細胞凋亡,增加腎臟綜合征發(fā)生發(fā)展[8]。目前,多采用藥物治療心肌梗死,西醫(yī)長時間治療毒副作用較大,因此尋找合適藥物干預對改善心肌梗死腎臟損傷具有重要的臨床意義。

超聲檢查是診斷心肌梗死的無創(chuàng)輔助檢查,可對心臟功能進行準確檢查并評估心肌梗死嚴重程度。心肌梗死普遍存在心排血量減少,舒張末期容積減小,心室充盈壓力增加,進一步提高心臟壓力,導致LVSP、MAP及LVSP異常[9]。心肌梗死病人心肌組織存在不同程度的缺血缺氧,心室收縮不同步,限制了心臟每搏輸出量(SV)及心臟指數(shù)(CI)編導,從而影響心室收縮功能,導致LVEDP降低[10]。本研究結果顯示,經(jīng)葡萄籽多酚干預后心肌梗死大鼠心臟功能改善,高濃度葡萄籽多酚的干預作用與血府逐瘀膠囊相似。

血府逐瘀膠囊是在血府逐瘀湯基礎上加減而成的中成藥,是治療“胸中血府血瘀”諸癥的常用藥物,主要成分當歸、川芎可養(yǎng)血通經(jīng);生地可活血養(yǎng)陰;赤芍、牛膝、紅花活血化瘀;柴胡、桔梗具有疏肝解郁、宣肺理氣作用[11]。血府逐瘀膠囊治療可改善急性心肌梗死急診經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術后心力衰竭病人心功能,其機制可能與減輕炎癥反應、保護血管內皮功能有關[12]。葡萄籽多酚是一種在蔬菜和水果中存在的天然提取物,包括多種化學元素,其中白藜蘆醇可減少心肌梗死大鼠心臟及腎臟氧化,而多酚在抗腫瘤同時具有強大的心臟功能保護作用。吳婷玉等[13]研究顯示,葡萄籽多酚提取物可降低高血壓大鼠血壓,通過抗氧化發(fā)揮心臟功能保護作用。

心肌組織中血管緊張素及醛固酮可加重腎組織纖維化,加快腎小球硬化,降低腎功能[14-15]。本研究結果顯示,葡萄籽多酚可改善大鼠腎功能,并存在濃度依賴性,高濃度葡萄籽多酚對心肌梗死大鼠腎功能改善最顯著,與武報佳[16]研究結果相似。葡萄籽多酚屬于血管擴張劑,發(fā)揮保護心臟,對其他器官特異性保護作用得到證實,對阿霉素及順鉑導致的急性腎損傷時采用葡萄籽多酚干預對腎損傷有預防作用,其機制與葡萄籽多酚增加抗氧化作用有關。本研究結果顯示,葡萄籽多酚治療后大鼠心肌組織及腎組織病理形態(tài)均有所改善,其機制與抑制大鼠腎組織NF-κB/IκKβ信號通路有關。

NF-κB是多功能核轉錄因子,主要由5種不同亞單位組成,其典型的成員為NF-κBp65,靜息狀態(tài)下NF-κB與IκKβ結合后,與無活性的三聚體共同存在于細胞質,細胞受到刺激后NF-κB被激活,暴露細胞核靶點,使其順利進入細胞核,從而發(fā)揮調控靶基因的作用[17]。NF-κB/IκKβ可介導氧化反應及炎癥反應等,加重心肌梗死病理生理發(fā)生。IκK是IκB上的蛋白激酶,也是激活NF-κB的經(jīng)典產(chǎn)物,可結合IκBα相關Ser36等指標磷酸化發(fā)生降解,促使NF-κB分離,啟動細胞核基因轉錄作用[18]。NF-κB可調控免疫及炎癥相關基因,啟動腎小管上皮細胞損傷機制,通過上調p53表達介導腎組織纖維化。本研究結果顯示,葡萄籽多酚可抑制心肌梗死大鼠腎組織NF-κB/IκKβ信號活性,存在濃度依賴性。葡萄籽多酚通過阻斷IκKβ信號表達,減少相關信號發(fā)生降解,加快NF-κB失活而減少腎組織氧化及炎癥應激損傷。梁冬冬等[19]研究顯示,葡萄籽多酚活性成分兒茶酸通過減少NF-κB表達,抑制其進入細胞核,降低了p53磷酸化,改善腎小球上皮細胞存活周期,提高細胞存活率。李方等[20]研究顯示,葡萄籽多酚中包含的白藜蘆醇可改善高脂血癥大鼠腎臟功能,其作用機制可能與抑制NF-κB活性、降低單核細胞趨化蛋白-1表達有關。

綜上所述,葡萄籽多酚可增加心肌梗死大鼠心臟功能,提高腎功能,改善心肌及腎臟組織病理損傷,其機制與抑制NF-κB、NF-κBp65及IκKβ活性有關。