基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗探討半夏-陳皮藥對治療卒中后抑郁的作用機(jī)制

徐春悅,冀旭艷,衛(wèi) 治,李寶玲

卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是腦卒中常見的并發(fā)癥之一[1]。有研究表明,約33.33%的中風(fēng)幸存者受卒中后抑郁的影響,導(dǎo)致卒中后抑郁病人自殺率較高[2]。目前的治療藥物存在價格昂貴、副作用顯著等不足。因此,迫切需要尋找經(jīng)濟(jì)有效的中醫(yī)藥方法治療卒中后抑郁。本課題組前期臨床研究及動物實驗均證實,疏腦解郁湯治療卒中后抑郁有較好的療效[3-4]。由于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用,因此,疏腦解郁湯治療卒中后抑郁的作用機(jī)制尚未明確。疏腦解郁湯是李寶玲主任針對卒中后抑郁病人氣郁、痰阻、血瘀病機(jī),臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗方,半夏-陳皮是疏腦解郁湯中理氣化痰的代表藥對。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實驗充分挖掘疏腦解郁湯中半夏-陳皮藥對在分子水平多成分、多靶點(diǎn)對卒中后抑郁的整體調(diào)節(jié)作用,為疏腦解郁湯的實驗研究及臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 半夏、陳皮有效成分的收集與篩選 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)分別檢索半夏、陳皮的化合物成分,并根據(jù)藥物代謝動力學(xué)進(jìn)行篩選,初步篩選出活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18。篩選結(jié)束后,統(tǒng)一在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt,https：//www.uniprot.org)將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并參照文獻(xiàn)報道補(bǔ)充未預(yù)測到的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息。

1.2 卒中后抑郁相關(guān)靶點(diǎn)篩選 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org)中以“post-stroke depression”“post stroke depression”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,在DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca)進(jìn)行靶點(diǎn)補(bǔ)充。合并所有檢索結(jié)果,刪除重復(fù)值得到疾病靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將卒中后抑郁的靶點(diǎn)基因與半夏-陳皮成分靶點(diǎn)通過韋恩圖獲得半夏、陳皮主要活性成分作用于卒中后抑郁的預(yù)測靶點(diǎn),利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將篩選獲得的潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING平臺(https：//string-db.org/),設(shè)置種屬為“Homo Sapiens”(人類),相互作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9),其余設(shè)置為默認(rèn)值,得到PPI網(wǎng)絡(luò),并通過Cytoscape 3.8.2中的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,得到潛在的蛋白質(zhì)功能模塊。

1.5 靶點(diǎn)富集分析 利用Metascape平臺對半夏-陳皮治療卒中后抑郁相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路分析,將有效成分與疾病的交集靶點(diǎn)錄入Metascape平臺,設(shè)置P<0.01,分析主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進(jìn)行富集分析,保存數(shù)據(jù)結(jié)果并借助SangerBox網(wǎng)站(http：//sangerbox.com/)進(jìn)行可視化分析。

1.6 實驗驗證

1.6.1 實驗動物 SD大鼠90只,雄性,無特定病原體(SPF)級,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京斯貝福技術(shù)有限公司,許可證號：SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(22±3)℃,相對濕度45%～55%。

1.6.2 實驗試劑與儀器 Bax購自武漢三鷹公司,批號：00039968;Bcl-2購自Abcam公司,批號：GR249198-76;GAPDH購自生工生物工程有限公司,批號：GC14AA0011;二抗(Goat Anti-rabbit)購自BiOS公司,批號：BJ08079044;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Solarbio公司,批號20200918;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自SEVEN公司,批號：20191101;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速凝膠配置試劑盒購自SEVEN公司,批號：20200914;Buffer購自SEVEN公司,批號：20191115;彩虹130廣譜蛋白marker購自Solarbio公司,批號：917A021;脫脂奶粉購自Solarbio公司,批號：322R0515;等滲緩沖鹽溶液(TBST)自制;電泳液自制;電轉(zhuǎn)液自制。超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自賽文SEVEN生物技術(shù)有限公司,批號：20200904。雙向電泳系統(tǒng)(PROTEANi12 IEF Mini-PROTEAN Tetra PROTEAN 11 XL)購自美國Bio-Rad公司;半干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(TRans-Blot SemiDry PowerPac Universal)購自美國Bio-Rad公司;高性能成像分析儀(HD2)購自美國ProteinSimple公司。

1.6.3 模型制備 采用大腦中動脈栓塞(MCAO)+慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激(CUMS)進(jìn)行卒中后抑郁模型構(gòu)建,參照Zea longa線栓法[5]制作局灶性腦缺血后再灌注大鼠模型,術(shù)后1周,選取神經(jīng)功能評分1～3分的大鼠,聯(lián)合慢性不可預(yù)知性刺激建立卒中后抑郁模型。

1.6.4 分組及給藥 卒中后抑郁大鼠模型建立成功后,隨機(jī)分為正常組、卒中后抑郁組、鹽酸帕羅西汀組、半夏-陳皮組。隨機(jī)分組后,連續(xù)灌胃28 d,其中正常組、卒中后抑郁組給予生理鹽水灌胃,給藥劑量均為 10 mL/kg,每日1次。正常組、模型組灌胃生理鹽水(10 mL/kg);鹽酸帕羅西汀組灌胃鹽酸帕羅西汀溶液,劑量 2 mg/kg。疏腦解郁湯中半夏10 g,陳皮10 g,半夏-陳皮組以大鼠與人等效劑量的2倍予以0.42 g/kg給藥,每日1次,連續(xù)灌胃28 d。

1.6.5 觀察指標(biāo) 給藥結(jié)束后,進(jìn)行組織取材,采用蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白。各組大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉,下腔靜脈采血后,于冰袋上進(jìn)行斷頭取腦。取出腦組織后,冰上剝離海馬組織,置于1.5 mL的EP管內(nèi),保存于-80 ℃冰箱。根據(jù)BCA蛋白定量濃度,以總蛋白50 μg進(jìn)行上樣。配制10%分離膠、5%濃縮膠。按照濃縮膠80 V、分離膠120 V的恒壓條件電泳,待溴酚藍(lán)到達(dá)膠底時停止電泳。按照25 V、30 min的條件進(jìn)行半干轉(zhuǎn)。使用含5%蛋白溶液封閉,4 ℃冰箱過夜。封閉過夜后將膜取出,用TBST洗滌3次,每次10 min。加入一抗4 ℃冰箱過夜,回收一抗,TBST洗滌3次,加入二抗孵育1.5 h。TBST洗滌3次,利用超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。最后,將PVDF膜置于高性能成像分析儀HD2系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 半夏-陳皮活性成分靶點(diǎn)的獲取 初步提取半夏化學(xué)成分116種、陳皮化學(xué)成分63種,經(jīng)藥物代謝動力學(xué)篩選去重后獲得靶點(diǎn)活性成分13種,其中半夏8種、陳皮5種,詳見表1。半夏成分作用靶點(diǎn)83個、陳皮成分作用靶點(diǎn)61個,合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)118個。

表1 半夏-陳皮主要活性成分

2.2 半夏-陳皮治療卒中后抑郁核心靶點(diǎn)預(yù)測及篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點(diǎn)5 423個。根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為卒中后抑郁的潛在靶點(diǎn),通過GeneCards得到卒中后抑郁靶點(diǎn)Score最大值為70.2,最小值為0.24,兩次中位數(shù)篩選為4.73,故設(shè)定Score>4.73的靶點(diǎn)為卒中后抑郁的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn),合并后刪除重復(fù)值,最終得到1 366個卒中后抑郁相關(guān)靶點(diǎn)。通過Venny(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny /index.html)在線工具,繪制半夏-陳皮與卒中后抑郁相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖,詳見圖1。

圖1 半夏-陳皮與卒中后抑郁相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析 網(wǎng)絡(luò)中包含133個節(jié)點(diǎn),其中藥物節(jié)點(diǎn)2個、活性化合物節(jié)點(diǎn)13個、靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)118個,網(wǎng)絡(luò)中圓形代表藥物,菱形代表基因,六邊形代表化合物活性成分,菱形代表靶基因。在網(wǎng)絡(luò)中,每條邊表示節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的互作關(guān)系[6]。運(yùn)用Cytoscape中的“Network analyze”進(jìn)行度值分析,度值表示節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目。根據(jù)活性化合物成分和靶點(diǎn)的中心度值大小進(jìn)行篩選,排名居前5位的分別為MOL002670卡文定堿、MOL004328柚皮素、MOL000358 β-谷甾醇、MOL005828川陳皮素、MOL000449豆甾醇。在靶點(diǎn)中,排名居第1位的是雌激素受體1(ESR1),其余靶點(diǎn)包括凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)、雄激素受體(AR)、半胱氨酸天冬酶-3(Casp3)、半胱天冬蛋白酶-9(Casp9)、癌基因(JUN)、嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)、細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2),詳見圖2。

圖2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 半夏-陳皮治療卒中后抑郁靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將半夏、陳皮活性成分靶點(diǎn)與卒中后抑郁靶點(diǎn)取交集,進(jìn)而將交集靶點(diǎn)提交至 STRING平臺,得到PPI網(wǎng)絡(luò),詳見圖3。利用Cytoscape 3.8.2中的MCODE插件,通過分子復(fù)合物檢測算法分析相互作用關(guān)系,得到模塊(module)。module是PPI網(wǎng)絡(luò)的潛在子網(wǎng),連線密度較高,是密度較高的部分[6]。因此,module被認(rèn)為是具有生物學(xué)意義的集合,有必要進(jìn)一步識別內(nèi)在module。詳見圖4。

圖3 半夏-陳皮與卒中后抑郁靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 半夏-陳皮與卒中后抑郁靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的module

2.5 富集分析 通過Metascape平臺進(jìn)行基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析。設(shè)置P<0.01,主要的生物過程包括細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、膜電位的調(diào)控、正調(diào)控細(xì)胞死亡、離子運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)、對缺氧的反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路。詳見圖5。

圖5 GO生物過程富集分析柱狀圖

對代謝通路進(jìn)行富集分析,結(jié)果顯示,主要的通路涉及癌癥通路、血清素能突觸、雌激素信號通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、神經(jīng)活性配體-受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、長壽調(diào)節(jié)途徑、花生四烯酸代謝等。利用氣泡圖對富集基因數(shù)排名居前20位的通路進(jìn)行可視化分析?？v軸表示通路名稱,橫軸表示富集因素百分比,氣泡大小表示富集在該通路的基因數(shù)目。詳見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 蛋白免疫印跡法結(jié)果分析 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示：相較于正常組,模型組Bax表達(dá)升高,Bcl-2表達(dá)減少;相較于模型組,鹽酸帕羅西汀組、半夏-陳皮組Bax表達(dá)減少,Bcl-2表達(dá)升高,Bcl-2/Bax上調(diào)。詳見圖7。

圖7 各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)條帶圖 (A為正常組;B為模型組;C為鹽酸帕羅西汀組;D為半夏-陳皮組)

3 討 論

半夏、陳皮作用于卒中后抑郁的主要活性成分包括卡文定堿、柚皮素、β-谷甾醇、川陳皮素、豆甾醇。相關(guān)研究表明,柚皮素通過抑制氧化應(yīng)激介質(zhì)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá),改善反復(fù)低氧應(yīng)激小鼠的抑郁行為[7]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn),川陳皮素通過AMP依賴性蛋白激酶(AMPK)途徑促進(jìn)自噬,改善NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎癥小體介導(dǎo)的炎癥,調(diào)控抑郁癥。

本研究KEGG分析涉及的通路主要包括癌癥通路血清素能突觸、雌激素信號通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、神經(jīng)活性配體-受體通路等,結(jié)合前期研究結(jié)果[9],說明疏腦解郁湯調(diào)控卒中后抑郁的機(jī)制與cAMP/BDNF通路有關(guān)。本課題組前期免疫組化實驗發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組BDNF表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組比較,疏腦解郁湯組BDNF表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義[9]。疏腦解郁湯高劑量組可顯著提高卒中后抑郁大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,改善卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀,對卒中后抑郁大鼠海馬組織損傷具有保護(hù)作用[10]。cAMP/蛋白激酶A(PKA)/磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)/BDNF通路在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮著重要的作用。突觸后神經(jīng)元鈣離子濃度增加可激活腺苷酸環(huán)化酶,引起PKA活化[11-12]。cAMP可使絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)被運(yùn)送到細(xì)胞核,之后CREB引起下游靶基因BDNF表達(dá),從而影響原始突觸的生長和新的突觸形成,進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶[13-15]。GO生物過程富集分析顯示半夏-陳皮具有正調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。相關(guān)研究表明,卒中后抑郁的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān),慢性應(yīng)激通過促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,減少突觸聯(lián)系,最終導(dǎo)致抑郁樣行為發(fā)生[16-18]。另有研究顯示,橙皮苷通過上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2和下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá),抑制氯化鋁誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。BDNF前體通過調(diào)控額前皮質(zhì)凋亡信號影響腦卒中后抑郁大鼠行為[20]。

PPI網(wǎng)絡(luò)中密度較高的module顯示,Bax、Bcl-2是半夏、陳皮調(diào)控卒中后抑郁的重要靶點(diǎn),因此,對Bax、Bcl-2進(jìn)行實驗證實顯得尤為重要。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),充分挖掘疏腦解郁湯干預(yù)卒中后抑郁的作用機(jī)制,采用藥對形式進(jìn)行研究。疏腦解郁湯中除了半夏、陳皮藥對,還有活血化瘀、寧心安神類藥對,復(fù)方成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜,仍需進(jìn)一步開展研究。

綜上所述,半夏、陳皮藥對作為疏腦解郁湯的主要理氣化痰藥對,可上調(diào)Bcl-2/Bcl-2比例,正調(diào)控細(xì)胞死亡進(jìn)程,預(yù)測疏腦解郁湯調(diào)控卒中后抑郁的作用機(jī)制與改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。