基于代謝組學(xué)探討補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證的效應(yīng)機(jī)制

趙鐘輝,郭蓉娟,冉 超,朱曉晨

腦卒中是我國成年人致死、致殘的首位病因,具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1],腦梗死又稱缺血性腦卒中,居腦卒中發(fā)病率和死亡率的首位。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,急性腦梗死病人經(jīng)積極救治后,存活率明顯提高,但部分人留有偏癱、失語等不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀的病人進(jìn)入恢復(fù)期,給家庭和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。有研究表明,腦梗死后3個(gè)月內(nèi)是病人神經(jīng)功能恢復(fù)的最佳階段,因此把握恢復(fù)期的治療是提高腦梗死病人生活質(zhì)量的關(guān)鍵[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)降低了急性腦梗死病人死亡率,但對(duì)腦梗死恢復(fù)期的治療目前尚無特效藥物,而中醫(yī)藥以特有的優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于該病的臨床治療中。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腦梗死屬于“中風(fēng)病”范疇,恢復(fù)期多見本虛標(biāo)實(shí),本虛以氣虛、陰虛為主,標(biāo)實(shí)多為血瘀、痰濕。中醫(yī)證候研究顯示,氣虛血瘀證是該病的主要中醫(yī)證型[4],益氣活血類中藥治療腦梗死恢復(fù)期具有優(yōu)勢(shì),可改善病人神經(jīng)功能缺損癥狀,補(bǔ)陽還五湯是治療本病的經(jīng)典方劑。本研究采用補(bǔ)陽還五湯用于恢復(fù)期腦梗死病人,通過臨床療效觀察和代謝組學(xué)分析闡釋其療效并對(duì)其部分作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 腦梗死的西醫(yī)診斷參照2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[5]中的相關(guān)內(nèi)容：急性起病,多為安靜狀態(tài)下起病;局灶神經(jīng)功能缺損(一側(cè)肢體或面部麻木或無力,語言障礙等),少數(shù)為全面神經(jīng)功能缺損;影像學(xué)顯示有責(zé)任缺血性病灶時(shí)癥狀或體征持續(xù)時(shí)間不限,缺乏影像學(xué)責(zé)任病灶時(shí)癥狀或體征持續(xù)24 h以上;排除非血管性病因;腦MRI/CT排除腦出血。

中醫(yī)診斷參照2015年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制定的《中醫(yī)臨床診療指南釋義·腦病分冊(cè)》[6],①疾病診斷：臨床表現(xiàn)為神志昏蒙、口舌歪斜、半身不遂、言語謇澀或語不達(dá)意、甚或不語、偏身麻木;出現(xiàn)眩暈、頭痛、瞳神變化、飲水嗆咳、目偏不瞬、步履不穩(wěn)等。②病程診斷：急性期為發(fā)病2周以內(nèi),昏迷者可延長到發(fā)病4周;恢復(fù)期為發(fā)病2周至6個(gè)月;后遺癥期為發(fā)病6個(gè)月后。③氣虛血瘀證證候診斷參照《缺血性中風(fēng)證候診斷表》[7],通過計(jì)算每個(gè)證候要素的每項(xiàng)癥狀得分,各項(xiàng)相加得到總評(píng)分,氣虛血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)是氣虛量表評(píng)分≥10分,且血瘀量表評(píng)分≥10分。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 腦梗死恢復(fù)期病人納入標(biāo)準(zhǔn) 符合動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn);符合中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn),辨證為氣虛血瘀證;缺血性中風(fēng)證候診斷量表氣虛評(píng)分≥10分且血瘀評(píng)分≥10分;美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)評(píng)分3～22分;年齡40～80歲;發(fā)病2周至6個(gè)月;病人自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2.2 健康受試者納入標(biāo)準(zhǔn) 無任何臨床癥狀;年齡40～60歲;與腦梗死恢復(fù)期組一般資料匹配;自愿參加并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 短暫性腦缺血發(fā)作、進(jìn)展性腦卒中和心源性腦卒中;蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦出血;急性期進(jìn)行過機(jī)械取栓或溶栓等血管開通治療;3個(gè)月內(nèi)有過嚴(yán)重出血史或有消化性潰瘍等;合并有肝腎功能、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和風(fēng)濕免疫系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及合并嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)性疾病;妊娠期婦女或準(zhǔn)備妊娠,尿妊娠試驗(yàn)陽性,哺乳期婦女;精神障礙、智力障礙病人,昏迷病人,或聾、啞、盲等病人,不能配合檢查;過敏體質(zhì)或已知對(duì)本研究藥物成分過敏;同時(shí)參加其他臨床試驗(yàn)者或3個(gè)月內(nèi)參加過其他臨床試驗(yàn)。

1.4 一般資料 選取2019年1月—2019年10月于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腦病科住院及門診就診的腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人32例,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對(duì)照組,各16例,同時(shí)招募16名健康受試者。隨訪期間,治療組脫落2例,對(duì)照組脫落1例,最終納入治療組14例,對(duì)照組15例,健康組16名。治療組,男8例,女6例;年齡(61.64±8.96)歲;病程(4.57±3.06)周;體質(zhì)指數(shù)(25.14±3.76)kg/m2。對(duì)照組,男8例,女7例;年齡(62.07±8.71)歲;病程(6.20±5.36)周;體質(zhì)指數(shù)(26.64±3.51)kg/m2。健康組,男10名,女6名;年齡(61.38±7.62)歲;體質(zhì)指數(shù)(26.41±4.88)kg/m2。3組一般資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.5 治療方法 治療組及對(duì)照組均在腦梗死恢復(fù)期的常規(guī)西醫(yī)治療基礎(chǔ)上干預(yù),治療組予以口服補(bǔ)陽還五湯配方顆粒(黃芪60 g,當(dāng)歸尾20 g,地龍12 g,赤芍15 g,川芎12 g,桃仁12 g,紅花12 g)治療,早晚各1袋,治療12周。對(duì)照組予以等量安慰劑(糊精和矯味劑)治療,兩組療程一致。上述配方顆粒全部由華潤三九藥業(yè)有限公司統(tǒng)一制作。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 療效指標(biāo) 分別在入組當(dāng)天、治療第12周末對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行缺血性中風(fēng)證候要素量表評(píng)分和 NIHSS評(píng)分。①中醫(yī)療效評(píng)價(jià)：根據(jù)治療前后氣虛、血瘀證候積分變化,對(duì)兩組差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。②西醫(yī)療效評(píng)價(jià)：根據(jù)治療前后NIHSS評(píng)分變化,參照1995年全國第四次腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的臨床療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評(píng)定,基本痊愈：NIHSS評(píng)分減少90%～100%;顯著進(jìn)步：NIHSS評(píng)分減少46%～89%;進(jìn)步：NIHSS評(píng)分減少18%～45%;無效：NIHSS評(píng)分減少或增加<18%;惡化：神經(jīng)功能缺損評(píng)分增加>18%。

1.6.2 安全性指標(biāo) 包括體溫、脈搏、呼吸、血壓等生命體征,血、尿常規(guī),肝腎功能,心電圖,并詳細(xì)記錄研究中出現(xiàn)的任何不良反應(yīng)。

1.6.3 血清代謝組學(xué)檢測(cè) 將50 μL血清樣本加入含有內(nèi)標(biāo)(甲醇∶乙腈=1∶1)的沉淀劑450 μL中,渦旋混勻60 s;以4 ℃,13 000 r/min離心10 min后吸取上清液100 μL,置于Thermo Q EXACTIVE液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中準(zhǔn)備進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。儀器名稱：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀。色譜柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm,2.1 mm×50 mm。液相條件：水(含2 mmoL/L甲酸銨和0.1%甲酸),乙腈;梯度洗脫,分析時(shí)間0～18 min,進(jìn)樣量5 μL,流速0.25 mL/min。洗脫梯度程序：0～1 min,5%乙腈;1～5 min,5%乙腈;5～8 min,60%乙腈;8～11 min,100%乙腈;11～14 min,100%乙腈;14～15 min,60%乙腈;15～18 min,5%乙腈。樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用電噴霧電離(ESI)正負(fù)離子掃描模式,參數(shù)為噴霧電壓3 000 V;蒸發(fā)溫度350 ℃;鞘氣35 Arb;輔助氣10 Arb;毛細(xì)管溫度320 ℃;S-lens RF50。監(jiān)測(cè)模式：一級(jí)全掃描(Full scan),二級(jí)數(shù)據(jù)依賴性掃描(Full MS/dd-MS2)。參數(shù)：一級(jí)全掃描(Full scan)：分辨率：70 000;AGC target：1e6;Maximun TT：100 ms;掃描范圍：質(zhì)荷比(m/z)70～1 050。二級(jí)數(shù)據(jù)依賴性掃描(Full MS/dd-MS2)：分辨率：35 000;AGC target：1e5;Maximun TT：50 ms;碰撞能量(NCE)：20 eV、40 eV、60 eV。

血清代謝組學(xué)資料應(yīng)用中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院自建的Tracefounder軟件對(duì)LC-MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,獲得變量保留時(shí)間_質(zhì)荷比(rt_mz)、分子量(comPMW)、觀察量(樣本)和峰強(qiáng)。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)。變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)反映每個(gè)變量對(duì)模型解釋的貢獻(xiàn)度,定義當(dāng)代謝物的VIP值>1.0時(shí),認(rèn)為對(duì)模型有顯著貢獻(xiàn)。利用MetaboAnalyst 4.0軟件分析VIP>1.0的主要差異代謝物,選擇P>0.1作為影響的主要代謝通路。

2 結(jié) 果

2.1 NIHSS評(píng)分 與治療前比較,兩組治療后NIHSS評(píng)分均降低(P<0.05);治療后,兩組NIHSS評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.671,P=0.561)。詳見表1。

表1 兩組治療前后NIHSS評(píng)分比較 單位：分

2.2 中醫(yī)證候評(píng)分 與治療前比較,兩組治療后氣虛及血瘀評(píng)分均顯著降低(P<0.01);治療后,治療組較對(duì)照組氣虛評(píng)分更低(P<0.05),兩組治療后血瘀評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.774)。詳見表2、表3。

表2 兩組治療前后氣虛評(píng)分比較(±s) 單位：分

表3 兩組治療前后血瘀評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.3 臨床療效 根據(jù)兩組治療前后NIHSS評(píng)分變化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)比較兩組臨床療效,結(jié)果顯示,兩組均無惡化病人,治療組總有效率高于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 兩組臨床療效比較

2.4 腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證與健康對(duì)照組血清代謝組學(xué)比較

2.4.1 PCA PCA可明顯區(qū)分健康者和腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人(干預(yù)前)的血清代謝組整體差異,詳見圖1。

圖1 不同性別腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人與健康人PCA得分圖(A為男性,粉色表示腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證男性病人,綠色表示健康男性;B為女性,綠色表示腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證女性病人,粉色表示健康女性)

2.4.2 差異分層聚類分析 不同性別組間差異血清代謝組聚類分析見圖2。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與變量信息;顏色深淺反映變量值大小,紅色表示含量升高,綠色表示含量降低,顏色越深表明變化量越大。

圖2 不同性別腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人與健康人血清代謝組差異分層聚類熱圖(A為男性,紅色表示腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證男性病人,綠色表示健康男性;B為女性,綠色表示腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證女性病人,紅色表示健康女性)

2.4.3 代謝產(chǎn)物差異變化 基于VIP>1.0和ANOVA過濾P<0.05,篩選出健康受試者與腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證受試者的差異代謝產(chǎn)物。

男性：共發(fā)現(xiàn)46個(gè)差異代謝產(chǎn)物,與健康人(J)相比,腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人(A)有34個(gè)代謝物質(zhì)的血清含量水平上升,12個(gè)代謝物質(zhì)水平下降;水平上升的代謝物質(zhì)有磷脂酰膽堿(PC)(16：1(9Z)/22：5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/20：3(8Z,11Z,14Z))、PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(o-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(18：3(6Z,9Z,12Z)/16：0)、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、PC(o-18：0/22：6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：0)、鞘磷脂(SM)(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d17：1/24：0)、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：0/22：0)、SM(d18：1/20：0)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)(18：1(11Z))、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、LysoPC(16：1(9Z))、LysoPC(17：0)、乳酸、L-纈氨酸、植物鞘氨醇、L-脯氨酸、L-亮氨酸、油酸、D-葡萄糖、L-乙酰肉堿、肌醇;水平下降的代謝物質(zhì)有全賴氨酸、組胺、硬脂酸、煙酰胺、棕櫚酸、瓜氨酸、脫氫表雄酮、3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸、維生素C、PC(O-16：0/18：2(9Z,12Z))、3-氨基丁酸、丙酰肉堿。詳見表5。

女性：共發(fā)現(xiàn)51個(gè)差異性代謝產(chǎn)物,與健康人(J)相比,腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人(X)有33個(gè)代謝物質(zhì)的血清含量水平上升,18個(gè)代謝物質(zhì)水平下降。水平上升的代謝物質(zhì)有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(14：0/18：1(9Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、SM(d18：0/18：1(11Z))、SM(d18：1/14：0)、SM(d18：1/18：0)、SM(d18：1/18：1(11Z))、SM(d18：0/18：0)、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、油酸、L-乙酰肉堿、亞油酸、瓜氨酸、棕櫚酸、花生四烯酸、2-羥基丁酸、二十二碳六烯酸、十六烷酮、癸酰肉堿、煙酰胺、組胺、L-纈氨酸、二十二碳五烯酸、9-癸酰膽堿、L-辛烷基肉堿、N-(3-氧代碘癸?；?-L-高絲氨酸內(nèi)脂、3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸、硬脂酸、亞油酰肉堿、丙烯酰肉堿;水平下降的代謝物質(zhì)有PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(O-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(O-18：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：0/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：0/22：6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、SM(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)(0：0/18：2(9Z,12Z))、LysoPE(0：0/18：1(9Z))、左旋肉堿、脫氫表雄酮、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物、肌酸、景天庚酮糖。詳見表6。

綜合不同性別的組間差異血清代謝產(chǎn)物,腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人與健康人相比,男性和女性血清代謝產(chǎn)物共同升高的有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、油酸、L-乙酰肉堿、L-纈氨酸,下降的有脫氫表雄酮。

表5 男性內(nèi)源性物質(zhì)變化(VIP>1.0)

表6 女性內(nèi)源性物質(zhì)變化(VIP>1.0)

2.4.4 涉及的代謝通路 利用MetaboAnalyst 4.0軟件分析VIP>1.0的具有差異的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,選擇P>0.1為影響代謝物質(zhì)改變的主要代謝通路。男性腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人代謝物質(zhì)改變涉及的代謝通路有6條,分別是淀粉與蔗糖代謝、精氨酸生物合成、煙酸和煙酰胺代謝、組氨酸代謝、磷酸肌醇代謝、甘油磷脂代謝,詳見表7。女性腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人代謝物質(zhì)改變涉及的代謝通路有6條,分別是亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、精氨酸生物合成、煙酸和煙酰胺代謝,組氨酸代謝和甘油磷脂代謝,詳見表8。通路分析見圖3。橫坐標(biāo)Pathway Impact代表通路的重要性值,縱坐標(biāo)-log(P)代表代謝通路分析的顯著性水平;代謝通路的Pathway Impact和-log(P)值越大,圓圈越大,代表代謝差異的相關(guān)性越強(qiáng)。

表7 男性代謝通路分析結(jié)果

表8 女性代謝通路分析結(jié)果

圖3 不同性別腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人的重要代謝通路分析圖(A為男性;B為女性)

2.5 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證的血清代謝組學(xué)效應(yīng)

2.5.1 PCA PCA得分圖見圖4。

圖4 補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證前后的PCA得分圖(A為男性;B為女性。X1、X2分別代表治療前后治療組病人,J代表健康受試者)

2.5.2 差異分層聚類分析 治療組不同性別用藥前后血清代謝組聚類分析見圖5。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與變量信息。顏色深淺反映變量值大小,紅色表示含量升高,藍(lán)色表示含量降低,顏色越深表明變化量越大。

圖5 治療組用藥前后差異分層聚類分析熱圖(A為男性;B為女性。X1、X2分別代表治療前后治療組病人,J代表健康受試者)

2.5.3 代謝產(chǎn)物差異變化 經(jīng)過ANOVA過濾,篩選出VIP>1.0和P<0.05的代謝物。

男性：共發(fā)現(xiàn)39個(gè)差異代謝產(chǎn)物,與治療前相比,治療后有32個(gè)代謝物質(zhì)的血清含量水平上升,7個(gè)代謝物質(zhì)水平下降。水平上升的代謝物質(zhì)有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/22：5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(18：3(6Z,9Z,12Z)/16：0)、PC(o-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：0)、PC(14：0/22：1(13Z))、乳酸、SM(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d17：1/24：0)、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：1/20：0)、SM(d18：0/22：0)、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、LysoPC(17：0)、LysoPC(P-18：0)、LysoPC(20：2(11Z,14Z))、L-纈氨酸、油酸、煙酰胺、亞油酸、花生四烯酸、L-脯氨酸、L-乙酰肉堿、L-色氨酸、2-羥基丁酸、3-氨基丁酸;下降的物質(zhì)有瓜氨酸、組胺、3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸、棕櫚酸、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、丙酰肉堿。詳見表9。

女性：共發(fā)現(xiàn)37個(gè)差異代謝產(chǎn)物,與治療前相比,治療后有27個(gè)代謝物質(zhì)的血清含量水平上升,10個(gè)代謝物質(zhì)水平下降。水平上升的代謝物質(zhì)有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(14：0/22：0)、SM(d18：0/18：1(11Z))、SM(d18：1/14：0)、SM(d18：1/18：0)、SM(d18：1/18：1(11Z))、SM(d18：0/18：0)、SM(d18：1/16：0)、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、亞油酸、花生四烯酸、癸酰肉堿、脫氫異雄酮硫酸鹽、L-辛酰肉堿、9-癸酰肉堿、反式-2-十二烯酰肉堿、順式-5-十四烯酰肉堿、16-二氫鞘氨醇、二十二碳五烯酸、4-羥基脯氨酸、3,5-十四碳二烯碳鳥嘌呤、十二烷酰肉堿、D-葡萄糖、全賴氨酸;下降的物質(zhì)有油酸、L-乙酰肉堿、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、左旋肉堿、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯(lián)物、LysoPE(0：0/18：1(9Z))、2-羥基丁酸、二十二碳六烯酸、棕櫚酸。詳見表10。

綜合不同性別的差異血清代謝產(chǎn)物,經(jīng)補(bǔ)陽還五湯治療后,腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證男性和女性受試者共同升高的血清代謝產(chǎn)物有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：1(13Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1)、PC(o-18：1)、SM(d18：1)、SM(d18：0)、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、亞油酸、花生四烯酸,下降的物質(zhì)有棕櫚酸。

表9 治療組男性病人治療前后代謝物質(zhì)變化

2.5.4 涉及的代謝通路 治療組男性治療前后代謝物質(zhì)變化涉及的重要代謝通路有7條,分別是亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、精氨酸生物合成、鞘磷脂代謝、組氨酸代謝、色氨酸代謝和甘油磷脂代謝。詳見表11。治療組女性治療前后代謝物質(zhì)變化涉及的重要代謝通路有5條,分別是亞油酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、花生四烯酸代謝、鞘磷脂代謝和甘油磷脂代謝。詳見表12。重要通路分析圖見圖6。橫坐標(biāo)Pathway Impact代表的是通路的重要性值,縱坐標(biāo)-log(P)代表代謝通路分析的顯著性水平;代謝通路的Pathway Impact和-log(P)值越大,圓圈越大,代表代謝差異的相關(guān)性越高。

表11 治療組男性病人治療前后涉及的代謝通路

表12 治療組女性病人治療前后涉及的代謝通路

圖6 治療組不同性別病人治療后涉及的重要代謝通路分析圖(A為男性;B為女性)

2.6 安全性指標(biāo) 治療過程中,兩組血、尿常規(guī),肝腎功能及心電圖檢查均未見明顯異常,且均未發(fā)現(xiàn)與服藥有關(guān)的不良反應(yīng)。

3 討 論

補(bǔ)陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》,是治療中風(fēng)病氣虛血瘀證的經(jīng)典方劑。本研究結(jié)果表明,補(bǔ)陽還五湯治療腦梗死恢復(fù)期方面宏觀療效確切,尤其在改善氣虛證候方面較安慰劑療效更顯著。為進(jìn)一步探索機(jī)制,研究采用LC-MS/MS的分析方法,篩選出與腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證相關(guān)及應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯治療前后的病人血清代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)變化主要與能量代謝、磷脂代謝、脂肪酸代謝和氨基酸代謝過程有關(guān)。同時(shí)研究通過對(duì)比不同性別受試者的代謝物質(zhì)變化情況,發(fā)現(xiàn)某些代謝物質(zhì)在不同性別中表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì),可能與性別密切相關(guān),但相關(guān)證據(jù)缺乏,尚待進(jìn)一步研究。本研究提示的重要代謝途徑多數(shù)集中在磷脂代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、類固醇類激素代謝等方面,與機(jī)體的能量合成、血管內(nèi)皮炎性損傷反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化形成、神經(jīng)元修復(fù)等過程密切相關(guān)。

3.1 磷脂代謝 磷脂主要包括PC、LysoPC、SM、磷脂酰乙醇胺(PE)和LysoPE,這些分子構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分,在調(diào)節(jié)膜酶活性、膽固醇穩(wěn)態(tài)和信號(hào)通路等方面發(fā)揮著重要的作用[9]。PC、LysoPC和SM占到了血清磷脂的95%以上,均含有膽堿,是血清中的3種主要磷脂。其中,PC占細(xì)胞總磷脂的40%～50%,對(duì)脂蛋白膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著重要的作用[10]。磷脂在細(xì)胞生長增殖,維持機(jī)體新陳代謝,增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面發(fā)揮著重要作用[11]。某些磷脂可作為心腦血管疾病、癌癥、糖尿病、腎病等疾病的潛在標(biāo)志物。LysoPC是PC經(jīng)過內(nèi)皮脂肪酶激活后產(chǎn)生的,具有參與細(xì)胞生長和分化的特定受體[12-13],與炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病和肥胖等有關(guān)[14]。體外研究和動(dòng)物模型表明,LysoPC既有促動(dòng)脈粥樣硬化的生物活性,同時(shí)也具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的生物活性[15-16],不同LysoPC生物活性由酰鏈長度和飽和度決定,不同種類的LysoPC作用尚未完全揭示。SM是神經(jīng)酰胺與PC或PE結(jié)合后形成的一種磷脂,在神經(jīng)細(xì)胞軸突周圍的髓鞘中含量豐富,約18%的血漿磷脂均以SM的形式存在,已證實(shí)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇中均富含SM。體內(nèi)SM水平與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān),有研究顯示,動(dòng)脈粥樣硬化病人體內(nèi)總的SM含量高于無動(dòng)脈粥樣硬化人群[17]。本研究顯示,腦梗死恢復(fù)期受試者血清中的多種PC、SM、LysoPC較正常人呈升高趨勢(shì),少數(shù)PC、SM水平下降,表明病人體內(nèi)存在磷脂代謝改變,發(fā)病后發(fā)生磷脂代謝變化,可能與動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致腦梗死的病理機(jī)制相關(guān)。

3.2 氨基酸代謝 纈氨酸是一種必需氨基酸,存在于人體中的為L-纈氨酸,Chen等[18]研究顯示,L-纈氨酸可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,具有抗感染的潛力,影響炎癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸。倪宇昕等[19]研究顯示,L-纈氨酸可促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)。本研究顯示腦梗死恢復(fù)期受試者血清L-纈氨酸較對(duì)照組升高,提示腦梗死恢復(fù)期病人機(jī)體存在炎癥,可能與血管炎性改變密切相關(guān),提示急性腦血管事件的機(jī)體炎癥狀態(tài)可持續(xù)長達(dá)數(shù)周至數(shù)月,從代謝組學(xué)角度闡釋了腦梗死恢復(fù)期的炎癥病理持續(xù)過程。

3.3 脂肪酸代謝 油酸是一種單不飽和脂肪酸,是游離脂肪酸的主要成分。正常情況下,游離脂肪酸是三大能源物質(zhì)代謝過程中的重要組成部分。肝糖原耗盡時(shí),脂肪組織將中性脂肪分解為游離脂肪酸充當(dāng)能源使用,亦可引起體內(nèi)游離脂肪酸增加。油酸可保護(hù)大腦免受缺血性損傷,油酸在大腦缺血性損傷后積聚可能是對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)性反應(yīng),腦梗死恢復(fù)期病人血清油酸水平升高可反映大腦中油酸含量的增加,提示其對(duì)損傷大腦的保護(hù)作用,但具體機(jī)制尚未明確。同時(shí),大量的油酸有助于促進(jìn)游離脂肪酸的生成,為機(jī)體供能提供更多的底物。

棕櫚酸是一類常見的飽和脂肪酸,是人體內(nèi)含量最多的游離脂肪酸,含量過多易引起膽固醇升高、血管內(nèi)皮損傷、動(dòng)脈硬化,并導(dǎo)致心腦血管疾病。腦梗死的病理基礎(chǔ)為腦組織缺血缺氧壞死,組織缺氧條件下可誘導(dǎo)異常增殖細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α激活,并抑制棕櫚酸的代謝分解,從而導(dǎo)致其大量積累[20],使脂肪酸β氧化障礙,影響了體內(nèi)能量代謝。補(bǔ)陽還五湯治療后,血清棕櫚酸水平下降,表明補(bǔ)陽還五湯可能通過改善體內(nèi)缺氧狀況促進(jìn)腦缺血后因低氧導(dǎo)致的棕櫚酸β氧化,調(diào)節(jié)脂肪酸代謝,從而改善體內(nèi)能量代謝,促進(jìn)腦梗死恢復(fù)期病人的康復(fù)。

肉堿可與長鏈脂肪酸結(jié)合形成酰肉堿,從而使長鏈脂肪酸以酰肉堿形式通過線粒體膜進(jìn)入線粒體,參與脂肪酸β氧化產(chǎn)生能量[21],是脂肪酸供能的必要物質(zhì)。血清肉堿(游離肉堿和酰肉堿)可反映機(jī)體總?cè)鈮A水平,有助于判斷機(jī)體是否存在脂肪酸氧化障礙和能量代謝異常。L-乙酰肉堿是左旋肉堿的一種活化形式,在大腦、肌肉和精子中含量豐富,能通過血腦屏障,傳遞脂肪酸進(jìn)入線粒體,完成脂肪酸β氧化過程,生成三磷酸腺苷(ATP)供能協(xié)助能量轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明,腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人血清L-乙酰肉堿較健康受試者均有所增加,提示腦梗死恢復(fù)期病人體內(nèi)可能出現(xiàn)了脂肪酸代謝障礙引起能量代謝異常,從而導(dǎo)致肉堿水平代償性升高。與臨床表現(xiàn)出的氣虛癥狀相對(duì)應(yīng),提示中醫(yī)的“氣虛”狀態(tài)與機(jī)體能量代謝障礙具有潛在的相關(guān)性。

3.4 類固醇激素 脫氫表雄酮(DHEA)是一種雄激素,對(duì)腦缺血模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。已有研究表明,腦卒中急性期出現(xiàn)的認(rèn)知障礙與體內(nèi)DHEA濃度下降密切相關(guān)[22]。脫氫異雄酮硫酸鹽(DHEAS)是DHEA的硫酸化代謝物,DHEA和DHEAS水平下降與神經(jīng)元功能障礙和變性有關(guān),可能是由于這些類固醇激素可保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元免受有害物質(zhì)的傷害。另有研究表明,血清DHEA水平與神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示,腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人血清DHEA水平低于健康人,提示DHEA保護(hù)缺血后損傷的神經(jīng)元的作用有限,易引起腦梗死恢復(fù)期病人認(rèn)知功能的下降,對(duì)預(yù)測(cè)疾病相關(guān)的認(rèn)知能力下降可能具有一定作用。

綜上所述,補(bǔ)陽還五湯可一定程度調(diào)節(jié)腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人物質(zhì)代謝水平,降低血清部分飽和脂肪酸(棕櫚酸)水平,提高部分不飽和脂肪酸(亞油酸、花生四烯酸)水平,改善部分磷脂代謝(磷脂酰膽堿類、鞘磷脂類)水平,從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化,保護(hù)缺血后受損的神經(jīng)細(xì)胞,改善機(jī)體能量代謝,從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的潛在作用。除去目前已知的可被藥物影響的磷脂、油酸等代謝物質(zhì),本研究結(jié)果顯示,腦梗死恢復(fù)期病人血清L-乙酰肉堿、L-纈氨酸水平升高及DHEA水平降低,因此可能具有作為疾病標(biāo)志物的潛力,為相關(guān)藥物的研發(fā)提供了新思路。然而,腦缺血后的物質(zhì)代謝變化復(fù)雜,本研究僅初步探索了腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證病人的血清代謝組學(xué)特征,并初步提示了補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后的人體代謝水平變化及不同性別間代謝物質(zhì)變化的復(fù)雜性,藥物如何通過影響差異代謝物質(zhì)對(duì)疾病發(fā)揮治療作用需進(jìn)一步探索和驗(yàn)證,今后可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,結(jié)合血、唾液、尿、便等多重生物學(xué)樣本進(jìn)行多組學(xué)聯(lián)合的研究,利用靶向組學(xué)和生物示蹤技術(shù),期待進(jìn)一步揭示中醫(yī)經(jīng)典方劑治療本病的作用機(jī)制。