H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光識(shí)別琥珀酰膽堿

高瑞晗,邱 菲,叢 航

(貴州省大環(huán)化學(xué)及超分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

琥珀酰膽堿是一種煙堿型乙酰膽堿受體阻斷劑,常作為骨骼肌松弛劑在臨床手術(shù)中用作麻醉劑[9-10];但在人體內(nèi)過(guò)量吸收會(huì)導(dǎo)致心律失常,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)＜吧Ｒ虼顺鲇诎踩紤],它的使用應(yīng)受到嚴(yán)格控制。利用色譜法[11-12]和光譜法[10]測(cè)定琥珀酰膽堿的含量,具有檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)范圍窄、靈敏度低等缺點(diǎn)。這促使我們探索一種更靈敏的方法來(lái)分析琥珀酰膽堿。

本文通過(guò)引入H2O2增敏發(fā)光主體的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,構(gòu)建基于羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光傳感器,并利用電化學(xué)發(fā)光手段考察膽堿類(lèi)物質(zhì)與其主客體作用及靈敏性識(shí)別?；谥骺腕w相互作用,利用其空腔包結(jié)琥珀酰膽堿,在H2O2增敏條件下,大環(huán)主體羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng),從而建立了一種新的、靈敏的方法以檢測(cè)琥珀酰膽堿。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

30% H2O2,琥珀酰膽堿,氫氧化鈉,磷酸鹽緩沖溶液(PBS),試劑均購(gòu)于A(yíng)ldrich Alfa Aesar化學(xué)試劑公司、北京伊諾凱公司;所有實(shí)驗(yàn)用水為超純水。羧甲基取代benzo[3]uril由我們課題組開(kāi)發(fā)方法[8]合成。

1.2 儀器

ECL測(cè)試和電化學(xué)信號(hào)測(cè)試均使用LK5100電化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(天津蘭力科高科技公司);實(shí)驗(yàn)用常規(guī)三電極體系,工作電極為玻碳電極(Φ=3 mm),參比電極為Ag/AgCl電極,對(duì)電極為鉑絲電極。

1.3 電極預(yù)處理

將玻碳電極用直徑為3 mm的α-Al2O3拋光粉進(jìn)行打磨,后依次用超純水、無(wú)水乙醇分別超聲5 min,直至玻碳電極表面呈鏡面般光滑。實(shí)驗(yàn)采用的是工作電極為玻碳電極,參比電極為Ag/AgCl電極,對(duì)電極為鉑絲電極的經(jīng)典三電極體系。

1.4 電化學(xué)發(fā)光測(cè)試

每次量取2 mL的測(cè)試液于比色皿中,用裸電極測(cè)試在不同pH條件、不同濃度共反應(yīng)試劑下進(jìn)行羧甲基取代Benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)。電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置:光電倍增管電壓(PMT)為800 V,電壓掃描范圍為-0.2～0.9 V,靈敏度為4檔。

1.5 電化學(xué)發(fā)光滴定

配制2.0×10-4mol/L羧甲基取代Benzo[3]uril與琥珀酰膽堿濃度比分別為1∶0,1∶0.25,1∶0.5,1∶0.75,1∶1.0,1∶1.25,1∶1.5,1∶1.75,1∶2.0的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)研究

羧甲基取代benzo[3]uril在中性和堿性介質(zhì)中具有優(yōu)異的水溶性,通過(guò)測(cè)試在不同pH值下的電化學(xué)發(fā)光性質(zhì),考察其在不同pH條件下的電化學(xué)發(fā)光行為,如圖1所示。

圖1 不同pH條件下羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-時(shí)間曲線(xiàn)圖Fig.1 ECL intensities-time curves of carboxymethyl substituted benzo[3]uril at different pH

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH值在7.0～12.0時(shí),其電化學(xué)發(fā)光呈現(xiàn)不同的強(qiáng)度。當(dāng)pH為7.0時(shí),羧甲基benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光幾乎不能被觀(guān)察到。羧甲基取代benzo[3]uril的陰極電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著酸性的逐漸減弱呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。當(dāng)pH=10.0時(shí),開(kāi)始觀(guān)察到在+753 mV時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)極發(fā)光。在pH=10.0～12.0時(shí),隨著氫氧根離子濃度的增加,陽(yáng)極發(fā)光增強(qiáng)并伴隨其陰極電化學(xué)發(fā)光的逐步減弱。因此,其電化學(xué)發(fā)光可以歸因于不同pH條件下溶液發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的超氧自由基與大環(huán)化合物羧甲基benzo[3]uril形成激發(fā)態(tài)分子的弛豫現(xiàn)象,這類(lèi)似于魯米諾在堿性溶液條件下的發(fā)光機(jī)理[13-14]?；趯?shí)驗(yàn)結(jié)果的啟發(fā),我們?cè)O(shè)想在溶液中加入H2O2,通過(guò)電化學(xué)反應(yīng)生成超氧自由基,增強(qiáng)羧甲基benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光,從而建立一個(gè)H2O2增敏的高靈敏響應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光傳感器,并用于識(shí)別環(huán)境體系中低濃度的膽堿類(lèi)物質(zhì)。H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)琥珀酰膽堿示意圖如圖2所示。

圖2 H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)琥珀酰膽堿示意圖Fig.2 Diagram of H2O2 sensitized carboxymethyl substituted benzo[3]uril electrochemiluminescence sensor for the detection of succinylcholine

2.2 H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)傳感器條件優(yōu)化

考慮到電化學(xué)發(fā)光傳感器普遍應(yīng)用在生物分析和免疫檢測(cè)領(lǐng)域,我們嘗試在pH=7.0的中性水溶液條件下構(gòu)建以羧甲基取代benzo[3]uril為主體的電化學(xué)發(fā)光傳感器,并通過(guò)加入H2O2來(lái)達(dá)到增強(qiáng)羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光的目的。如圖3所示,未加入H2O2時(shí),大環(huán)化合物的電化學(xué)發(fā)光很弱。隨著雙氧水的加入,羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸升高。在濃度為0.100 mol/L時(shí),電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到峰值16 000,可能由于H2O2電化學(xué)反應(yīng)提供了反應(yīng)所需的超氧自由基。但是,隨著H2O2的加入(0.500或1.000 mol/L),發(fā)光強(qiáng)度下降,表明高濃度的超氧自由基發(fā)生自淬滅。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.100 mol/L H2O2進(jìn)行增敏。

圖3 電化學(xué)發(fā)光傳感器在不同濃度H2O2下共反應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-電壓曲線(xiàn)Fig.3 ECL intensity-voltage curves of the ECL sensor at different concentrations of H2O2 co-reaction

在上述優(yōu)化條件下,采用包含0.100 mol/L H2O2的羧甲基取代benzo[3]uril-H2O2電化學(xué)發(fā)光傳感器定量檢測(cè)pH=7.0溶液中琥珀酰膽堿的含量。我們通過(guò)測(cè)試不同琥珀酰膽堿濃度下的電化學(xué)發(fā)光性質(zhì),考察傳感器電化學(xué)發(fā)光行為。如圖4所示,羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著琥珀酰膽堿濃度的增加而降低,這可能是benzo[3]uril和琥珀酰膽堿發(fā)生主客體作用形成穩(wěn)定的包結(jié)物,由此減少了羧甲基取代benzo[3]uril激發(fā)態(tài)產(chǎn)生的結(jié)果。在琥珀酰膽堿濃度為1.0×10-12～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi),羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化值與琥珀酰膽堿濃度的負(fù)對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,得到相應(yīng)的線(xiàn)性校正曲線(xiàn):I=-354.12lgC-959.38,其中R2=0.993 7,如圖5所示。通過(guò)相應(yīng)的計(jì)算得到該傳感器對(duì)琥珀酰膽堿實(shí)現(xiàn)超低檢測(cè)限為1.0×10-15mol/L (S/N=3 ),其靈敏度遠(yuǎn)高于以往研究中采用的熒光光譜、紫外光譜和高效液相色譜檢測(cè)方法(表1),表明羧甲基取代benzo[3]uril電化學(xué)發(fā)光傳感器具有優(yōu)越的性能。

圖4 電化學(xué)發(fā)光傳感器與不同濃度琥珀酰膽堿的響應(yīng)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-時(shí)間曲線(xiàn)Fig.4 ECL intensity-time curves of the ECL sensor in response to different concentrations of succinylcholine

圖5 電化學(xué)傳感器電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與琥珀酰膽堿濃度的線(xiàn)性關(guān)系Fig.5 Linear relationship between the intensity of electrochemiluminescence and the concentration of succinylcholine

表1 不同檢測(cè)手段對(duì)琥珀酰膽堿檢出限比較Tab.1 Comparison of detection limits of succinylcholine by different detection methods

3 結(jié)論

基于羧甲基取代benzo[3]uril這種新型的水溶性電化學(xué)發(fā)光載體,初步考察了羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光機(jī)理,通過(guò)溶液中的超氧自由基促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移,進(jìn)而生成羧甲基取代benzo[3]uril激發(fā)態(tài)分子,激發(fā)態(tài)分子躍遷至基態(tài)時(shí)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。為提高超氧自由基濃度,引入共反應(yīng)試劑H2O2,制備了一種基于H2O2增敏羧甲基取代benzo[3]uril的電化學(xué)發(fā)光傳感器,并將其應(yīng)用于琥珀酰膽堿的靈敏檢測(cè),檢出限低至1.0×10-15mol/L?；诖嗽斫⒘艘粋€(gè)基于H2O2敏化羧甲基取代benzo[3]uril傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)琥珀酰膽堿的高靈敏高選擇性識(shí)別。將大環(huán)化合物羧甲基取代benzo[3]uril應(yīng)用在電化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域,提高電化學(xué)分子檢測(cè)的篩選性,對(duì)拓寬超分子化學(xué)研究領(lǐng)域具有重要意義。