MEG3 基因在骨肉瘤中的研究進(jìn)展

劉凱 李寧 楊浩東

骨肉瘤 (osteosarcoma，OS) 是最常見(jiàn)的一種骨組織原發(fā)性惡性腫瘤，其病變部位主要位于長(zhǎng)骨干骺端，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性疼痛并伴有夜間加重。OS 在年輕患者中發(fā)病率較高，根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率在10～19 歲時(shí)達(dá)到峰值[1]。目前在臨床上治療骨瘤的手段主要包括手術(shù)、化療和放射治療等[2]，但因?yàn)槠鋹盒猿潭容^高、生長(zhǎng)迅速且容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此效果大都不盡如人意。近年來(lái)隨著新型輔助化療手段的普及，患者的 5 年總存活率雖然較以往相比有顯著提高，但也僅為 70% 左右，而其中發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者生存率更是不到 20%[3]。

目前，OS 的發(fā)病機(jī)制尚未得到完全闡述，因此尋求新的治療方法，提高患者的治療率和生存率成為 OS 領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。隨著 OS 基因?qū)W說(shuō)研究的深入，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (long noncoding RNA，LncRNA) 逐漸進(jìn)入了人們的視線，研究顯示 LncRNA 基因 MEG3 基因 (maternally expressed gene 3) 廣泛存在于人體正常組織中，其在多種腫瘤組織中的低表達(dá)表明 MEG3 基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而其在 MG-63、U-2OS 細(xì)胞系中的異常表達(dá)提示 MEG3 基因具有抑制 OS 細(xì)胞增殖、侵襲，同時(shí)促進(jìn) OS細(xì)胞凋亡的作用[4]。相關(guān)研究表明 MEG3 基因能夠通過(guò)降低相關(guān)其目標(biāo)靶基因的表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控 P53 蛋白從而抑制OS 的發(fā)生和發(fā)展。MEG3 基因能夠通過(guò) miR-524 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制 PI3K / AKT 信號(hào)通路的傳導(dǎo)促進(jìn) OS 細(xì)胞增殖和侵襲，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，同時(shí)推動(dòng)血管的新生[5]，進(jìn)一步影響 OS 的發(fā)生和發(fā)展。除此之外，MEG3 基因的DNA 甲基化也與 OS 的診療效果密切相關(guān)，MEG3 基因的表達(dá)缺失與其 DNA 的高甲基化狀態(tài)有關(guān)，可以通過(guò)降低其基因啟動(dòng)子的甲基化水平從而恢復(fù) MEG3 基因的正常表達(dá)。因此，現(xiàn)就 MEG3 基因在 OS 中的異常表達(dá)和作用機(jī)制進(jìn)行了綜述，為 OS 的診療提供新的思路。

一、MEG3 基因的結(jié)構(gòu)和功能

研究顯示 LncRNA 是包含超過(guò) 200 個(gè)核苷酸但不具備編碼蛋白能力的一種 RNA 分子[6]，其作為調(diào)節(jié)多種生物工程中的關(guān)鍵因子已經(jīng)成為調(diào)控 OS 發(fā)生的重要因素[7-9]。MEG3 基因作為母源表達(dá)的 LncRNA 基因長(zhǎng)度約為 1.6 kb核苷酸，位于人類(lèi)染色體 14q32.3 區(qū)域的 DLK-MEG3 印記區(qū)上[10]?；蚪M研究分析顯示 MEG3 基因包含 10 個(gè)外顯子，可通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生 12 種不同的剪接體，MEG3基因通過(guò)與目標(biāo) DNA 建立 RNA-DNA 三聯(lián)體從而調(diào)控其目標(biāo)靶基因的表達(dá)[11-12]。

MEG3 基因作為腫瘤抑癌因子在肝癌、胃癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)缺失[13]，研究表明，miR-29 能夠通過(guò)其啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)增加 MEG3 基因的表達(dá)水平，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖[14]；當(dāng) MEG3基因表達(dá)水平過(guò)高時(shí)還會(huì)與 miR-181s、miR-148a 以及miR-141 靶向結(jié)合，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[15]；同時(shí)，MEG3 基因能夠通過(guò)下調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2，上調(diào)凋亡促進(jìn)因子 Bax、Bad 的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖[16-17]；此外 MEG3 基因還能夠通過(guò)抑制 Bcl-2 的表達(dá)，從而改變線粒體膜的通透性，激活線粒體通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡[18]。同時(shí) MEG3 基因序列的多態(tài)性也與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。MEG3 基因主要通過(guò)多種機(jī)制來(lái)調(diào)控 OS 的發(fā)展，其中包括 P53 蛋白途徑、PI3K / AKT 信號(hào)通路、DNA 甲基化、Notch 和 TGF-β 信號(hào)通路等以及與 miRNAs 間的相互作用 (圖1)。隨著關(guān)于 MEG3 基因研究的進(jìn)一步進(jìn)展，其有望成為 OS 診斷、治療和預(yù)后的潛在靶點(diǎn)，在 OS 的臨床診療中發(fā)揮巨大作用，成為抑制 OS 發(fā)展的重要一環(huán)。

圖1 MEG3 基因與 OS 作用示意圖 (實(shí)線代表傳導(dǎo)過(guò)程，虛線代表作用途徑)Fig.1 Schematic diagram of the interaction between MEG3 gene and osteosarcoma (the solid line represented the conduction process, and the dotted line represented the action route)

二、MEG3 基因在 OS 中的作用機(jī)制

1.P53蛋白與 OS：P53蛋白是由 TP53 (tumorsuppressorpro-teinp53) 基因編碼的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，作為具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄能力的序列特異性 DNA 結(jié)合蛋白，其主要由 6 個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括兩個(gè)氮末端反式激活結(jié)構(gòu)域(TADs)、一個(gè)中央脫氧核糖核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DBD)、一個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域 (PRD)、一個(gè)四聚化結(jié)構(gòu)域 (TD)和一個(gè)碳末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域 (CTD)[19]。通過(guò)與位于靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的 P53 應(yīng)答元件結(jié)合可以激活多個(gè)基因的表達(dá)，因此被稱(chēng)為“基因組的守護(hù)者”[20-21]。在正常情況下，P53 蛋白通過(guò) MDM2 (murine / humandoubleminute 2)介導(dǎo)的 P53 泛素連接酶降解從而保持在極低的水平[22]，但同時(shí)可以通過(guò)脫氧核糖核酸損傷、代謝缺損、缺氧等多種細(xì)胞應(yīng)激源激活[23]。研究顯示，MEG3 基因過(guò)表達(dá)時(shí)能夠提高 P53 蛋白的穩(wěn)定性并通過(guò)多種途徑調(diào)控 P53 蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育。MEG3 基因在 OS 中的表達(dá)明顯減少，這與其生存率較低且容易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[24]。MEG3 基因的上調(diào)能夠通過(guò)降低 MDM2 的表達(dá)及其目標(biāo)靶基因 MMP9 的表達(dá)誘導(dǎo) P53 蛋白的表達(dá)從而導(dǎo)致 MG63 人 OS 細(xì)胞凋亡，抑制人的 OS 細(xì)胞繁殖、侵襲，進(jìn)一步抑制 OS 的發(fā)展[25]。

綜上所述，P53 作為腫瘤抑制因子能夠調(diào)節(jié)眾多靶基因的表達(dá)，而 MDM2 則是 P53 表達(dá)的主要抑制因子。MEG3 基因一方面通過(guò) MDM2 與 P53 的 N 端結(jié)構(gòu)域結(jié)合掩蓋了 P53 對(duì)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的訪問(wèn)并通過(guò) MDM2 使 P53 泛素化，從而針對(duì) P53 進(jìn)行蛋白酶體降解。提示 MEG3 基因可以通過(guò) MDM2 激活 P53 進(jìn)一步抑制 OS 細(xì)胞的增殖、侵襲，但其具體機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。

2.PI3K / AKT 信號(hào)通路與 OS：磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K) 和蛋白激酶 B (protein kinase B，AKT) 作為受生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等多種因素參與調(diào)控的信號(hào)通路，廣泛存在于各種細(xì)胞中，并參與細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖、轉(zhuǎn)錄和存活等多種細(xì)胞活動(dòng)[26-27]。其中PI3K 作為同時(shí)具有磷脂激酶和蛋白激酶兩種活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為 Ⅰ 型 PI3K 亞型(PI3Kα，β，γ)、Ⅱ 型 PI3K 亞型 (PI3KC2α，C2β，C2γ)以及 Ⅲ 型 PI3K[28]。其中Ⅰ 型 PI3K 是由催化亞單位(PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 或 PIK3CG) 和一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位組成的異二聚體激酶，由于容易被細(xì)胞表面受體活化，因此與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相連。Ⅰ 型 PI3K 通過(guò)磷酸化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸 (PI-4，5-P) 肌醇環(huán)的3’-羥基，轉(zhuǎn)導(dǎo)由受體酪氨酸激酶 (RTKs) 和 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs) 產(chǎn)生的上游信號(hào)進(jìn)而生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸鹽 (PIP3)，作為關(guān)鍵的脂質(zhì)第二信使，PIP3 將含有 pleckstrin homology (PH) 結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)蛋白集中到質(zhì)膜上，以促進(jìn)其活化或與其它效應(yīng)蛋白共定位[29-30]。研究表明，Myc 是上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶 (CDK) 4 的癌蛋白，PI3K 能夠通過(guò)增加 c-Myc 的表達(dá)水平并促進(jìn) OS 細(xì)胞的增殖和侵襲[31]。而 AKT 作為 PI3K / AKT 信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為 pleckstrin 同源性結(jié)構(gòu)域、中間激酶結(jié)構(gòu)域以及調(diào)節(jié)性羧基末端結(jié)構(gòu)域，根據(jù)氨基酸殘基的不同可將 AKTs 分為三種亞型，分別為 AKT1型、AKT2 型和 AKT3 型。AKT 主要通過(guò)兩個(gè)關(guān)鍵的磷酸化過(guò)程激活，第一步由磷酸化的蘇氨酸 308 (AKT1) 在激酶結(jié)構(gòu)域 phosphoinositide-dependent 蛋白激酶 (PDK1) 啟動(dòng)活化過(guò)程，隨后通過(guò) mTOR 復(fù)合物 2 (mTORC2) 在羧基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的絲氨酸 473 (AKT1) 磷酸化，該過(guò)程被PI3K 依賴(lài)機(jī)制激活并完全激活 AKT[32]。同時(shí)，含有 PIP3和 PIP2 的內(nèi)膜也被證明直接有助于 AKT 的激活[33-34]。AKT 在抑制細(xì)胞凋亡方面起著至關(guān)重要的作用，能夠通過(guò)降低 Bad 和 Bax 的表達(dá)水平，提高 Bcl-2 和 Bcl-xl 的表達(dá)水平抑制 OS 細(xì)胞的增殖[35]。

MEG3 基因依靠 PI3K / AKT 信號(hào)通路在 OS 細(xì)胞中的活躍表達(dá)，減少 OS 細(xì)胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡[36]。研究顯示，磷酸酶和張力蛋白同系物 (PTEN) 作為一種具有生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)功能的負(fù)調(diào)節(jié)因子可以阻斷 PI3K / AKT 信號(hào)通路的傳導(dǎo)[37]，而 MG3 基因可以通過(guò)激活 miR-524 進(jìn)一步抑制 PTEN 從而啟動(dòng) PI3K / AKT 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)一步促進(jìn) OS 細(xì)胞的增殖和侵襲[38-39]；Wu 等[40]通過(guò)用不同濃度的原花青素 (PB2) 處理 OS 細(xì)胞株及 OB 細(xì)胞，結(jié)果顯示，PB2 可以通過(guò)切斷 PI3K / AKT 信號(hào)通路從而抑制 OS細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo) OS 細(xì)胞凋亡。同時(shí) PI3K / AKT 信號(hào)通路在推動(dòng)血管新生方面也起著不可估量的作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 能夠促進(jìn)血管生成、血管重塑并且增加血管通透性。研究表明，MEG3 基因表達(dá)水平降低會(huì)抑制 VEGF 的表達(dá)，而 VEGF沉默又可以通過(guò)阻斷 VEGF / PI3K / AKT 信號(hào)通路抑制 OS細(xì)胞增殖、減少 OS 血管的生成并促進(jìn) OS 細(xì)胞凋亡[41-42]。

由此可得出 MEG3 基因可以通過(guò)控制 PTEN、PB2、VGEF 的表達(dá)水平抑制 PI3K / AKT 信號(hào)通路的傳導(dǎo)從而抑制 OS 細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo) OS 細(xì)胞凋亡并減少 OS 血管的新生，同時(shí)，MEG3 基因的異常表達(dá)還可以通過(guò)PI3K / AKT 信號(hào)通路降低 Bad、Bax 的表達(dá)水平并上調(diào)Bcl-2、Bcl-xl 的表達(dá)水平，進(jìn)一步抑制 OS 細(xì)胞的遷移和侵襲，在 OS 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為臨床上治療 OS 提供新的思路。

3.DNA 甲基化與 OS：研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA (miRNA)作為由內(nèi)源基因編碼的單鏈 RNA 分子通過(guò)與靶基因 3’ 非翻譯區(qū)堿基配對(duì)抑制翻譯并切割 mRNA，能夠參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡的能力，而由人類(lèi)染色體 14q32 區(qū)域編碼的的 miRNAs正是 OS 患者的良好預(yù)后因素[31,43-45]。DNA 甲基化作為調(diào)控 MEG3 基因表達(dá)的表觀遺傳事件之一，主要通過(guò)脫氧核糖核酸甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNMTs) 在胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸 (CpG) 的環(huán)境中表達(dá)發(fā)揮作用并參與 14q32 miRNAs 的表達(dá)調(diào)控[46]。Katherine 等[47]通過(guò)對(duì) 19 個(gè) OS 細(xì)胞系用miRNA (Agilent 陣列) 和甲基化數(shù)據(jù) (Illmina 27K 陣列) 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多個(gè) CpG 位點(diǎn)在侵襲型、轉(zhuǎn)移性、致癌性較高的細(xì)胞系中甲基化程度更高。同時(shí) Oshima 等[48]研究表明，DNA 去甲基化通過(guò)促進(jìn) ccctc 結(jié)合因子 (CTCF) 募集到 MEG3 基因差異甲基化區(qū) (MEG3-DMR)，而 MEG3-DMR 作為 14q32 miRNAs 表達(dá)的順式調(diào)控元件，能夠通過(guò)DNMT1 激活 MEG3-DMR 的去甲基化和 14q32 miRNAs 的表達(dá)，從而抑制 OS 細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移特性。

綜上所述，OS 中 MEG3 基因表達(dá)水平降低，可能與其基因啟動(dòng)子的甲基化水平過(guò)低有關(guān)，可以通過(guò)其啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)增加 MEG3 基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步激活14q32 miRNAs 的表達(dá)從而抑制 OS 細(xì)胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo) OS 細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出抑制 OS 發(fā)展的能力。

三、MEG3 基因在 OS 臨床治療中的價(jià)值

研究發(fā)現(xiàn)，MEG3 基因作為 OS 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物有望成為一種潛在的新型治療靶點(diǎn)來(lái)緩解 OS 患者的痛苦。Li 等[49]通過(guò)測(cè)量 pcDNA-MEG3 聯(lián)合傳導(dǎo)后的小鼠腫瘤體積并與空白組進(jìn)行對(duì)照，同時(shí)對(duì) Wnt / β-連環(huán)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) MEG3 能夠抑制miR-184 的表達(dá)，同時(shí)用 pcDNA-MEG3 聯(lián)合傳導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組中小鼠腫瘤體積明顯減小且存活率增加。提示 MEG3 可以通過(guò)靶向 miR-184 抑制并下調(diào) Wnt / β-連環(huán)蛋白通路從而抑制 OS 的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。Zhang 等[50]通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子，發(fā)現(xiàn)當(dāng) MEG3 高表達(dá)時(shí)能夠抑制 Notch1、Hes1、TGF-β 和 N-cadhern 的表達(dá)水平，同時(shí)提高 E-cadhern 的表達(dá)水平。提示 MEG3 基因作為 OS 臨床治療的新靶點(diǎn)能夠通過(guò)抑制 Notch 和 TGF-β 信號(hào)通路抑制 OS 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Sahin 等[51]通過(guò) HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑將 miR-664a 抑制劑分別轉(zhuǎn)染于 OS 細(xì)胞株 (U2-OS)和 OB 細(xì)胞株 (hFOB 1.19) 中，發(fā)現(xiàn) MEG3 與 miR-664a的表達(dá)水平呈反比關(guān)系，同時(shí)抑制 miR-664a 能顯著增加 MEG3 的表達(dá)并且通過(guò) MEG3 和 miR-664a 之間的相互作用影響 OS 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，提示 miR-664a 作為一種onco-microRNA 能夠抑制 MEG3 信號(hào)在 OS 中的傳導(dǎo)，并且 miR-664a / MEG3 可能作為一種新型標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)在 OS 的臨床診療中發(fā)揮作用。同時(shí) Sun 等[52]發(fā)現(xiàn)EWSAT1 也能通過(guò)抑制 MEG3 基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn) OS細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示 EWSAT1-MEG3 也可能是 OS 臨床治療的潛在靶點(diǎn)。目前針對(duì) MEG3 基因在 OS 的臨床治療中具有治療意義的新型潛在靶點(diǎn)缺乏相關(guān)的臨床試驗(yàn)，其準(zhǔn)確性和治療效果有待進(jìn)一步研究。

四、結(jié)語(yǔ)和展望

OS 是一種惡性程度較高、生長(zhǎng)迅速且容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性骨骼惡性腫瘤，其發(fā)病原因多與 OS 細(xì)胞的異常增生及基因突變有關(guān)。目前臨床上主要通過(guò)手術(shù)、熱療、化療和放療等手段來(lái)治療 OS，但臨床療效較差且容易復(fù)發(fā)。MEG3 在 OS 組織及細(xì)胞系中表達(dá)缺失與其 DNA 的高甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，當(dāng) MEG3 基因表達(dá)缺失時(shí)，可能會(huì)促進(jìn) OS 細(xì)胞的增值、侵襲并抑制 OS 細(xì)胞凋亡，從而參與 OS 的發(fā)生與發(fā)展；而當(dāng) MEG3 基因表達(dá)過(guò)度時(shí)則可能會(huì)通過(guò)其相關(guān)表觀遺傳學(xué)調(diào)控 P53 蛋白途徑、PI3K / AKT信號(hào)通路、Notch 和 TGF-β 信號(hào)通路以及與 miRNAs 的相互作用抑制 OS 的發(fā)展。目前研究顯示 MEG3 基因有望成為 OS 診斷、治療和預(yù)后的新型潛在靶點(diǎn)并且已經(jīng)成為 OS臨床研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。雖然目前的研究成果已經(jīng)證明了MEG3 基因在 OS 治療中的重要性，但其在 OS 中的作用機(jī)制和潛在的調(diào)控路徑還需要進(jìn)一步的挖掘和探索，相信隨著研究的不斷深入，以上問(wèn)題將會(huì)得到解決，從而為在臨床上應(yīng)用 MEG3 基因治療 OS 提供更加可靠的理論依據(jù)。