臨床特征聯(lián)合血清標(biāo)志物檢測預(yù)警模型在肺癌骨轉(zhuǎn)移診斷中的臨床價值

馬海洋 吳瓊 張勇

隨著社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展，國民的生活水平得到一定程度的提升，但隨即產(chǎn)生的環(huán)境污染問題更加嚴重，在一定程度上造成了空氣污染以及空氣質(zhì)量下降的問題，大大提升了我國呼吸道疾病以及肺部疾病的發(fā)生比例，間接增加了患者發(fā)生肺癌等惡性疾病的發(fā)生以及死亡風(fēng)險[1]。臨床中肺癌是發(fā)生率較高的惡性腫瘤，支氣管黏膜上皮發(fā)生嚴重病變是引發(fā)肺癌的主要原因，因此常稱為支氣管肺癌[2]。臨床中肺癌發(fā)生后，病情進展較快，臨床癥狀較為嚴重，包括對患者的生命安全以及健康造成嚴重威脅，使肺癌成為臨床惡性腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤疾病。已有相關(guān)數(shù)據(jù)證實，惡性腫瘤患者中發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的比例在 20%～60% 左右，其中老年肺癌患者是骨轉(zhuǎn)移的高危人群，因此在患有肺癌后及時進行骨轉(zhuǎn)移診斷并采取針對性的有效治療措施是降低患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險以及改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[3]。骨轉(zhuǎn)移主要指的是患者的骨結(jié)構(gòu)發(fā)生異常導(dǎo)致骨損傷以及骨性破壞等，人類骨質(zhì)主要由 Ⅰ 型膠原構(gòu)成，Ⅰ 型膠原主要由成骨細胞合成，并且合成以及分解的代謝產(chǎn)物會進入血液循環(huán)，通過臨床多種試劑檢測后可以有效反映機體的骨代謝水平，同時對骨基質(zhì)礦化具有重要作用。目前雖有相關(guān)研究是以肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物以及骨代謝指標(biāo)診斷價值為中心進行深入分析，但因為研究樣本量相對較少以及單一血清標(biāo)志物的診斷敏感度、特異度較差等導(dǎo)致獲得的研究數(shù)據(jù)參考價值較低，使相關(guān)研究結(jié)論仍存在一定爭議[4]。本次通過臨床基線特征聯(lián)合骨特異性堿性磷酸酶 (bALP)、癌胚抗原(CEA)、Ⅰ 型原膠原氨基端 (N 端) 延長肽 (PINP)、Ⅰ 型膠原交聯(lián)羧基端 (C 端) 肽 (CTx)、糖鏈抗原125 (CA125) 等血清標(biāo)志物和骨代謝指標(biāo)構(gòu)建預(yù)測模型并應(yīng)用于患者骨轉(zhuǎn)移診斷中，為后續(xù)提升臨床肺癌骨轉(zhuǎn)移診斷以及及時預(yù)測預(yù)防奠定研究基礎(chǔ)。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 2018 年 6 月至 2020 年 5 月，我院經(jīng)治的肺癌骨轉(zhuǎn)移患者；(2) 結(jié)合病理學(xué)檢查結(jié)果以及臨床影像結(jié)果確診，病理類型均為非小細胞肺癌者；(3) 篩選的患者資料具有較高完整度，年齡 ≤ 70 歲者；(4) ECOG 評分 ≤ 2 分，肝、腎等重要器官的功能運行無異常者；(5) 骨轉(zhuǎn)移診斷時檢測血清標(biāo)志物、骨代謝指標(biāo)水平者；(6) 診斷前未接受任何可能影響研究結(jié)果的干預(yù)治療者。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 無外傷骨折者；(2) 有高鈣血癥者；(3) 有甲狀腺功能亢進或減低病史者；(4) 有其它惡性腫瘤病史者。

二、一般資料

本研究共納入 206 例。男 112 例、女 94 例；年齡 32～70 歲，平均 (57.99±3.52) 歲。腺癌 139例、鱗癌 67 例。176 例的 ECOG 評分為 0～1 分，30 例 ECOG 評分為 2 分。肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)[5]：Ⅰ 期屬于早期，是腫瘤位于肺組織中尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。Ⅱ期屬于中期，指癌細胞已轉(zhuǎn)移到了肺門附近的淋巴結(jié)。Ⅲ 期屬于局部晚期，指癌細胞已經(jīng)進一步轉(zhuǎn)移到縱隔或肺外淋巴結(jié)，還包括少部分病灶非常大或侵犯腫瘤器官不利于手術(shù)的情況。Ⅳ 期屬于晚期，指腫瘤出現(xiàn)胸膜轉(zhuǎn)移，胸腔積液或者全身多處臟器的轉(zhuǎn)移 (表1)。

表1 研究對象基線資料Tab.1 Baseline data of subjects

三、方法

1.肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)準(zhǔn)：以骨顯像以及臨床癥狀為金標(biāo)準(zhǔn)[6]，診斷內(nèi)容如下：(1) 排除良性病變與其它外傷因素影響，骨顯像結(jié)果中超過 3 處的放射性核素出現(xiàn)大量聚集；(2) 骨顯像結(jié)果中 ≤ 2 處的放射性核素出現(xiàn)大量聚集并存在骨痛、病理性骨折等骨轉(zhuǎn)移臨床癥狀確診發(fā)生轉(zhuǎn)移；(3) 放射性核素檢查陰性，但存在骨痛、病理性骨折等骨轉(zhuǎn)移臨床癥狀則為發(fā)生骨轉(zhuǎn)移；(4) 骨顯像結(jié)果中出現(xiàn)大量聚集放射性核素且存在骨痛、病理性骨折等骨轉(zhuǎn)移癥狀。存在以上 4 條中任何一條均可確診。

2.標(biāo)本采集與檢測：晨起時間段內(nèi)采集 3 ml 研究對象的空腹靜脈血，按照轉(zhuǎn)速 2000 r / min 設(shè)定參數(shù)離心 8 min，取上清液并保存在 -20 ℃ 環(huán)境中。由專業(yè)人員嚴格按照操作流程對樣本進行批量檢驗，檢測方法為電化學(xué)發(fā)光免疫分析法 (ECLIA)。

3.外周血循環(huán)腫瘤細胞 (CTC) 數(shù)量測定方法：外周血 CTC 數(shù)量檢測采用 Cyttel-CTC-imFish 技術(shù)完成，收集患者 3.2 ml 晨起空腹前臂靜脈血，為防止血液被上皮細胞污染，取中段血 3.2 ml，按照3000 r / min 轉(zhuǎn)速以及 20 cm 離心半徑進行離心，去除上層清液并加入細胞裂解液，免疫磁珠包被特異性抗體后吸附白細胞并分離富集腫瘤細胞。用 CD45以及 8 號探針作為細胞熒光原位雜交反應(yīng)檢測的工具，鏡檢計數(shù)，出現(xiàn) 3 倍體及以上信號同時 CD45陰性為腫瘤細胞。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

對研究出現(xiàn)的數(shù)據(jù)進行有效處理的軟件是運用SPSS 22.0，計量資料進行正態(tài)性檢驗，計量資料中正態(tài)分布以x-±s形式表現(xiàn)，采用t檢驗，使用 (%)表示計數(shù)資料并進行χ2檢驗，多因素 Logistic 回歸法分析肺癌骨轉(zhuǎn)移的影響因素，P< 0.05，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義，制訂肺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)測模型并進行驗證。

結(jié) 果

一、骨顯像結(jié)果

肺癌患者共計 206 例，99mTe-MDP 診斷結(jié)果中骨轉(zhuǎn)移確診例數(shù)共計 67 例，骨轉(zhuǎn)移病灶中 1 個熱區(qū)、2 個熱區(qū)、熱區(qū) ≥ 3 個的例數(shù)分別為 10 例、23 例、34 例，共計 171 個；1.94% 的肺癌患者為 1 個熱區(qū)可疑骨轉(zhuǎn)移，共計 4 例；65.53% 的骨顯像未存在異常濃聚，共計 135 例。后經(jīng)確診，43 例骨顯像陽性患者確診發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，假陽性例數(shù)為 24 例；可疑病例中骨轉(zhuǎn)移的例數(shù)為 1 例；9.63% 骨掃描陰性患者為假陰性，共計 13 例。27.67% 為骨轉(zhuǎn)移確診比例，共計 57 例；骨顯像診斷的特異性為 81.88%、敏感度為 75.44%、漏診率為 22.81%、假陽性率為35.82%。骨轉(zhuǎn)移組與無骨轉(zhuǎn)移組的骨顯像陽性檢出率存在統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2= 66.497，P< 0.001)。42.11%患者的骨轉(zhuǎn)移灶累及肋骨或胸骨，共計 24 例；脊柱 19 例 (33.33%)，骨盆 15 例 (26.32%)，長骨 9 例(15.79%)，顱骨 5 例 (8.77%)。

二、單因素分析骨轉(zhuǎn)移組與無骨轉(zhuǎn)移組血清標(biāo)志物水平比較

骨轉(zhuǎn)移組的血清標(biāo)志物 CTC、CEA、CA125、PINP、bALP、CTx 水平均高于無骨轉(zhuǎn)移組 (P<0.001) (表2)。

表2 比較兩組患者血清骨轉(zhuǎn)移標(biāo)志物變化差異 ( x-±s )Tab.2 Comparison of changes in serum bone metastasis markers between the two groups (x- ± s)

三、單因素分析骨轉(zhuǎn)移組與無骨轉(zhuǎn)移組肺癌的臨床病理特征

Ⅰ 期、Ⅱ 期、Ⅲ 期、Ⅳ 期的占比分別為10.19%、7.28%、36.89%、45.64%，例數(shù)分別為21 例、15 例、76 例、94 例。骨轉(zhuǎn)移組的臨床分期、腺癌病理類型占比明顯高于無骨轉(zhuǎn)移組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P< 0.05) (表3)。

表3 單因素分析骨轉(zhuǎn)移組與無骨轉(zhuǎn)移組肺癌的臨床病理特征Tab.3 Univariate analysis of clinicopathological characteristics of lung cancer in the bone metastasis group and the non bone-metastasis group

四、多因素分析肺癌骨轉(zhuǎn)移的影響因素及建立預(yù)測模型

將P< 0.05 的 CEA、骨顯像、臨床病理分期、CA125、PINP、bALP 作為肺癌骨轉(zhuǎn)移變量為自變量，肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移為因變量，數(shù)據(jù)提示病理類型、病理分期、CEA、CA125、CTC、PINP、bALP為肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險因素 (表4，5)。

表4 變量賦值表Tab.4 Variable assignment table

表5 多因素分析肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的影響因素Tab.5 Multivariate analysis of the influencing factors of bone metastasis in lung cancer patients

以上回歸分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，回歸方程的擬合度R2= 0.271，擬合度顯著 (F= 4.012，P< 0.05)，說明本回歸模型存在有顯著意義，即自變量中至少有一個可以顯著影響?；貧w方程的殘差情況如圖1。

圖1 多元線性回歸方程標(biāo)準(zhǔn)化殘差直方圖Fig.1 Histogram of normalized residuals of multiple linear regression equations

五、臨床特征聯(lián)合血清標(biāo)志物肺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)測模型在肺癌骨轉(zhuǎn)移診斷中的價值驗證

根據(jù)以上的危險因素結(jié)果繪制列線圖構(gòu)建肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的預(yù)測模型，模型為 0.469 + CEA×0.481 +病理類型×0.544 + 臨床病理分×0.088 + CA125×0.318 + PINP×0.363 + bALP×0.439 + CTx×0.467 +CTC×0.476。將驗證組的肺癌數(shù)據(jù)代入列線圖中計算概率值。以 50% 為預(yù)測概率驗證的分界值，≥ 50%是骨轉(zhuǎn)移高危患者，< 50% 是骨轉(zhuǎn)移低危患者。臨床特征聯(lián)合血清標(biāo)志物肺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)測模型診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確率為 92.23，AUC 為 0.916，敏感度與特異度均在 90% 左右 (表6、7，圖2、3)。

圖2 肺癌患者骨轉(zhuǎn)移預(yù)測模型列線圖Fig.2 Prediction model of bone metastasis in patients with lung cancer

圖3 預(yù)測模型在肺癌患者骨轉(zhuǎn)移中的診斷效能 ROC 曲線Fig.3 ROC curve of the predictive model for the diagnosis of bone metastasis in lung cancer patients

表6 肺癌患者骨轉(zhuǎn)移預(yù)測模型檢出結(jié)果Tab.6 Detection results of bone metastasis prediction model in lung cancer patients

表7 預(yù)測模型在肺癌患者骨轉(zhuǎn)移中的診斷效能Tab.7 Diagnostic efficacy of prediction model in bone metastasis of lung cancer patients

討 論

肺癌骨轉(zhuǎn)移是肺癌患者在中后期常出現(xiàn)的一類疾病，病情嚴重者如不能及時發(fā)現(xiàn)并治療，極易對患者生命造成影響，嚴重威脅人類健康。對于此，加強監(jiān)測與早期治療至關(guān)重要[7]。隨著臨床檢測醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用放射性免疫技術(shù)以及肺癌血清標(biāo)志物研究深度的不斷增加，血清標(biāo)志物在肺癌診斷中的應(yīng)用效能得到進一步挖掘的同時提升了腫瘤診斷結(jié)果準(zhǔn)確率，而臨床相關(guān)檢測技術(shù)在腫瘤臨床療效以及預(yù)后診斷中的應(yīng)用價值也為惡性腫瘤研究發(fā)展提供數(shù)據(jù)支持。

骨形成、骨吸收標(biāo)志物較多，主要有未羧化骨鈣素 (ucOC)、抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)、CTx[8]。通過生物化學(xué)方法檢測血清或尿液的骨代謝指標(biāo)水平能有效反映骨代謝以及骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，對腫瘤的療效評估具有一定的指導(dǎo)意義。已有研究實驗結(jié)果表示骨代謝水平在一定程度上會影響骨轉(zhuǎn)移以及預(yù)后結(jié)局，但乳腺癌、前列腺癌是骨轉(zhuǎn)移相關(guān)研究的集中點，關(guān)于肺癌骨轉(zhuǎn)移的研究案例鮮少且研究結(jié)論尚未統(tǒng)一[9]。

成浩等[10]針對 143 例 Ⅰ～Ⅳ 期肺癌患者進行了深入研究，根據(jù)單因素以及多因素分析結(jié)果指出患者 PINP 或 PICP 升高發(fā)生預(yù)后不良的比例更高，但 PINP 和 PICP 并不是影響預(yù)后的獨立因素，在一定程度上可以說明 PINP、PICP 與肺癌患者骨轉(zhuǎn)移預(yù)后結(jié)局存在關(guān)聯(lián)。本研究中骨轉(zhuǎn)移組患者的 PINP明顯更高，PINP 是肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的獨立影響因素并被納入預(yù)測模型中，與以上研究結(jié)果相符，提示PINP 在肺癌骨轉(zhuǎn)移中具有較高診斷價值，分析其原因可能是在 Ⅰ 型前膠原、Ⅰ 型膠原的衍化過程中切斷氨基末端結(jié)構(gòu)，因此血清 Ⅰ 型前膠原水平可作為反映 Ⅰ 型膠原合成狀態(tài)以及骨形成的良好指標(biāo)，提示 Ⅰ 型膠原合成速度隨著 Ⅰ 型前膠原升高而增快，骨轉(zhuǎn)換活躍，因此在骨轉(zhuǎn)移時 PINP 會對應(yīng)發(fā)生變化[11]。成骨細胞分泌產(chǎn)生的 bALP 是一種 ALP同工酶，在成骨細胞活性中具有較高的敏感性。Vimalraj 等[12]指出肺癌患者的 bALP 高水平表達是促進疾病進展對危險因素 (RR：1.77；95%CI：1.19～2.64；P= 0.005)，死亡危險是正常者的 1.5倍 (RR：1.53；95%CI：1.15～2.03；P= 0.003)，證實預(yù)后不良因素中不包括 bALP，本研究中相比于骨轉(zhuǎn)移組，無骨轉(zhuǎn)移組的 bALP 水平更低，并且作為獨立影響因素被納入肺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)測模型中，提示 bALP 是可以反映肺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生情況的敏感指標(biāo)。其主要原因是在惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的細胞生理進程中血清 bALP 均有參與，因此在肺癌患者的骨轉(zhuǎn)移發(fā)生中 bALP 會出現(xiàn)較明顯的變化。本研究中 CTx在骨轉(zhuǎn)移組水平更高并且是影響因素之一，其主要是因為 CTx、NTx 等標(biāo)志物主要由 Ⅰ 型膠原降解產(chǎn)生，二者均具有較高的特異性，CTx 相比于 NTx，CTx 診斷骨吸收的特異性差，但在骨吸收診斷中具有較高的敏感性，因此在肺癌患者的骨轉(zhuǎn)移時具有較高的診斷價值[13]。

肺癌預(yù)后臨床研究中腫瘤標(biāo)志物是重點方向。多項研究數(shù)據(jù)顯示腫瘤標(biāo)志物會影響肺癌患者的預(yù)后，但研究對象具有一定局限性，多為早期肺癌，針對晚期肺癌患者的研究案例鮮少，腫瘤標(biāo)志物對肺癌骨轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的評估價值尚未明確。腫瘤標(biāo)志物之一的 CEA 在診斷肺癌中的靈敏度、特異度一般，與早期肺癌患者的預(yù)后結(jié)局存在密切關(guān)聯(lián)，但有研究不認同該觀點[14]。本研究結(jié)果顯示 CEA 是診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移的敏感指標(biāo)，分析其原因是 CEA 為臨床常用的腫瘤敏感標(biāo)志物，主要形成于細胞漿，經(jīng)細胞膜傳遞分泌于細胞外以及周圍體液中，在血清、胃液等體液中均可檢出，隨著患者病情的加重，患者的 CEA 水平會相應(yīng)增加[15]。早期 CA125在臨床診斷卵巢癌、預(yù)后判斷以及疾病復(fù)發(fā)預(yù)測中較為常用并且具有較高的敏感性和陽性率。已有研究發(fā)現(xiàn) CA125 在肺癌患者血清中呈高水平表達。近幾年 CA125 已成為肺癌的臨床標(biāo)志物研究重點，但多數(shù)研究是以 CA125 預(yù)測早期肺癌患者預(yù)后為切入點，關(guān)于晚期肺癌預(yù)后的研究案例較少。

目前，已文獻報道 CTC 在 PCa 患者中表達水平明顯高于正常人群，提示其可能對 PCa 診斷具有一定的應(yīng)用價值[16]。本研究結(jié)果顯示，CTC 是肺癌骨轉(zhuǎn)移的危險因素，并在呈高水平表達，與以上研究結(jié)果相符，提示 CTC 檢測能有效反映原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而起到輔助判斷病情進展的作用，主要是因為 CTC 是從機體腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中脫落進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞，大部分 CTC 在短時間內(nèi)可經(jīng)機體免疫系統(tǒng)清除或因自身循環(huán)周期而死亡，但依然存在少部分細胞聚集生長形成癌栓，并在患者組織中進展為轉(zhuǎn)移灶，從而參與了惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。因 CTC 細胞在不同人群中的水平存在一定差異，所以在后續(xù)的不同人群的肺癌骨轉(zhuǎn)移臨床診斷中應(yīng)通過優(yōu)化 CTC 檢測技術(shù)以及納入 CTC 變量校正因素等方式提升一致性。

許玉炫等[18]研究指出肺癌患者若是 N 期就更容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。已有研究表示相比于腺鱗癌、小細胞癌，肺腺癌是骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險最高的肺癌病理類型，與本研究的結(jié)果是一致的，原因分析如下：腺癌多發(fā)于黏液腺，多數(shù)為血液轉(zhuǎn)移，可通過向血管外生長對患者的肋骨、脊椎部位進行直接侵犯，同時經(jīng)脊柱、肺部的靜脈循環(huán)向全身的骨骼轉(zhuǎn)移，而臨床分期越高，表示患者的病情越嚴重，因此發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險越高[19]。

本研究的不足：(1) 通過邏輯回歸分析結(jié)果構(gòu)建研究模型的相關(guān)文獻較少；(2) 納入的研究樣本量相對較少；這可能會影響模型的應(yīng)用準(zhǔn)確性。所以后續(xù)研究中應(yīng)擴大樣本量并探尋其它的模型構(gòu)建優(yōu)化方案，以待進一步深入分析臨床特征聯(lián)合血清標(biāo)志物檢測預(yù)警模型能提升肺癌骨轉(zhuǎn)移的實際診斷價值。

綜上所述，診斷腫瘤骨轉(zhuǎn)移中，臨床特征聯(lián)合血清標(biāo)志物檢測預(yù)警模型對于診斷肺癌骨轉(zhuǎn)移擁有較高的診斷功能，可視為肺癌骨轉(zhuǎn)移的一種篩查方法，擁有較高的臨床實用價值。采取臨床特征聯(lián)合血清標(biāo)志物檢測預(yù)警模型能提升肺癌骨轉(zhuǎn)移的實際檢出率，在臨床中具有非常強的實用性。