葫蘆茶總多酚超聲-微波協(xié)同提取工藝研究

譚志燦，高 妮，丘思蘭

（1.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學校中藥制劑教學部，廣東 廣州 510430；2.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院/廣州醫(yī)科大學第五臨床學院，廣東 廣州 510700）

葫蘆茶為豆科植物葫蘆茶Tadehagi triquetrum(L.)Ohashi的干燥全株。本品味微苦，性涼，歸胃、大腸經(jīng)，具有清熱利濕、消滯殺蟲的功效。始載于清代《生草藥性備要》：“味澀性平。消食殺蟲，治小兒五疳，作茶飲”。民國《嶺南采藥錄》和《山草藥指南》均有記載。目前，葫蘆茶僅在地方標準中有收載，如廣東省中藥材標準第一冊（2004 年版）和福建省中藥材標準（2006 年版）。葫蘆茶為嶺南地區(qū)民間常用中草藥，主產(chǎn)于廣東、福建、廣西等地，常用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，濕熱積滯之脘腹?jié)M痛，膀胱濕熱之小便赤澀，水腫腹痛，妊娠嘔吐，小兒疳積[1]。研究表明[2，3]，葫蘆茶具有抑菌、驅(qū)蟲、抗炎、抗癌、抗過敏、抗氧化、降糖降脂等作用。葫蘆茶含有黃酮類、多酚類、三萜類、多糖類、鞣質(zhì)類等成分[4-6]，其中多酚類是重要的活性成分之一。本實驗采用Box-Behnken 效應面法設(shè)計實驗，對葫蘆茶總多酚超聲-微波協(xié)同提取工藝進行優(yōu)選，為葫蘆茶的綜合開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 JIUPIN-WB-1000W 型微波超聲波組合催化合成萃取儀（無錫久平儀器）；AEG-220 分析天平（日本Shimadzu 公司）；N4S 型紫外－可見分光光度計（上海精科）。

1.2 試藥 葫蘆茶（嶺南中藥飲片有限公司，批號2105001），經(jīng)鑒定為豆科Fabaceae葫蘆茶屬Tadehagi植物葫蘆茶Tadehagi triquetrum(L.)Ohashi的干燥全草，為正品；沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201906，純度：91.5%）；乙醇、碳酸鈉等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 沒食子酸對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品（純度91.5%）適量，加水溶解，制得濃度為0.1006 mg/ml 對照品溶液。

2.2 葫蘆茶總多酚供試品溶液的制備[7]將葫蘆茶飲片粉碎，過40 目篩，取葫蘆茶飲片粉末15 g，精密稱定，放入微波超聲波組合催化合成萃取儀中，加入80%乙醇300 ml，按照表1 的實驗設(shè)計提取2 次，提取液合并后回收乙醇，再加水至50 ml，濾過，取續(xù)濾液1 ml 置250 ml 量瓶中，加水至刻度，即得。

表1 葫蘆茶提取工藝試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3 測定波長的選擇 取對照品溶液0.2 ml 和供試品溶液1.0 ml，分別置10 ml 量瓶中，各加水至2.0 ml，加福林酚試劑0.5 ml，搖勻后放置8 min，再加15%的碳酸鈉溶液1.5 ml。用水稀釋至刻度，搖勻，冷卻至室溫，避光放置1 h。以隨行試劑為空白，照UV-Vis進行全波長掃描。根據(jù)沒食子酸和葫蘆茶總多酚的光譜圖，選擇748 nm 為測定波長。

2.4 標準曲線的繪制 取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分別置10 ml 量瓶中，各加水至2.0 ml，照“2.3”項下的方法，自“加福林酚試劑0.5 ml”起，測定吸光度A。以濃度c 為橫坐標、吸光度A 為縱坐標，繪制標準曲線，得標準方程A=89.5612c+0.0513（r=0.9991），線性范圍0.001 006～0.006 036 mg/ml。

2.5 葫蘆茶總多酚提取工藝優(yōu)選 采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)，通過單因素試驗確定提取溶劑、提取次數(shù)和料液比，分別為80%EtOH、2 次和20 ml/g，以效應面法考察微波功率、超聲功率和提取時間3 個因素對提取率的影響[8]。按照表1 的Box-Behnken 效應面法實驗設(shè)計進行試驗[9，10]，照“2.3”項下的方法測定吸光度A，計算葫蘆茶總多酚提取率Y，公式如下。

式中，c 為測定時的濃度（mg/ml），由標準曲線計算可得；D 為稀釋倍數(shù)，本實驗為2500；V 為溶液體積（ml），本實驗為50 ml；m 為取樣質(zhì)量（mg）。利用Design Expert 軟件對上述實驗結(jié)果擬合回歸方程：

結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)R2為0.9850，變異系數(shù)C.V.為0.48%，表明模型擬合度良好。對表1 實驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果顯示：有2 個線性項（B、C）、2 個二次項（B2、C2）和1 個交互相項（BC）對葫蘆茶總多酚提取率達極顯著水平（P＜0.01）；另外，微波功率的一次項（A）達顯著水平（P＜0.05）。失擬檢驗F=6.54，P=0.0507，失擬誤差不顯著大于純誤差，表明模型可接受，見表2。為更直觀地反映各自變量對響應值的影響，用Design Expert 軟件作出的等高線圖和效應面圖見圖1～圖6。

圖1 微波功率和超聲功率對響應值Y 的等高線圖

圖2 微波功率和超聲功率對響應值Y 的效應面圖

圖3 微波功率和提取時間對響應值Y 的等高線圖

圖4 微波功率和提取時間對響應值Y 的效應面圖

圖5 超聲功率和提取時間對響應值Y 的等高線圖

圖6 超聲功率和提取時間對響應值Y 的效應面圖

表2 顯著性檢驗及方差分析

2.6 最佳工藝驗證 結(jié)合回歸模型和生產(chǎn)實際，將微波功率設(shè)定為385 W，超聲功率設(shè)定為367 W，以20倍80%乙醇提取2 次，24 min/次。對該提取工藝進行6 次驗證試驗，平均提取率為3.83%（RSD=1.41%，n=6），與理論提取率3.84%接近，相對誤差為0.26%。表明所優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、重復性良好。

3 總結(jié)

葫蘆茶作為嶺南常用中草藥，民間多當涼茶飲用，對感冒發(fā)熱、小兒疳積、小便赤澀等癥狀有獨特的療效。本實驗對葫蘆茶總多酚的提取工藝進行研究，為其綜合開發(fā)利用提供參考。針對目前葫蘆茶提取研究的現(xiàn)狀，本實驗應用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取葫蘆茶中總多酚。在總多酚測定的實驗中，顯色操作尤其重要，顯色完成放置1 h 后，應盡快測定，否則影響實驗結(jié)果。通過考察微波功率、超聲功率和提取時間3 個重要因素，利用二次多項式回歸模型算出最優(yōu)解，并結(jié)合生產(chǎn)實際情況，最終確定了穩(wěn)定可行的最佳提取工藝。驗證實驗所得總多酚平均提取率為3.83%，與理論提取率相符，回歸模型預測良好。后續(xù)可對葫蘆茶總多酚的純化工藝和開發(fā)利用作進一步研究，充分挖掘葫蘆茶的應用價值。