正交法優(yōu)選調(diào)控秦艽次生代謝產(chǎn)物含量變化的條件

付歡歡 何懿菡 尹洋洋 胡偉 楊燁 岳正剛

摘 要：為優(yōu)選可抑制秦艽次生代謝產(chǎn)物含量變化的條件，該文采用3因素4水平正交試驗設(shè)計方法，共設(shè)計16組處理，研究洛伐他?。∕VA途徑抑制劑）、膦胺霉素（MEP途徑抑制劑）和取樣天數(shù)對秦艽中馬錢苷酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷4種主要環(huán)烯醚萜類化合物含量的影響。結(jié)果表明：（1）4種環(huán)烯醚萜類化合物含量變化受取樣天數(shù)影響最大，其次為膦胺霉素濃度，次之為洛伐他汀濃度。（2）以最佳抑制條件處理后，馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐芽菜苷含量分別下降了69%、36%、33%和4%?；谡环▋?yōu)選的抑制條件，對4種化合物均可抑制。綜上所述，可確定調(diào)控秦艽次生代謝產(chǎn)物含量變化的最佳抑制條件為膦胺霉素400 μmol·L－1，洛伐他汀50 μmol·L－1，取樣天數(shù)6 d，該條件為進(jìn)一步研究MEP和MVA途徑在環(huán)烯醚萜類化合物代謝合成中的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 正交試驗， MVA途徑， MEP途徑， 洛伐他汀， 膦胺霉素， 環(huán)烯醚萜

中圖分類號：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000－3142（2023）04－0777－08

Abstract：Gentiana macrophylla is a traditional Chinese herbal medicine for treating jaundice， hepatitis， and stomachic and choleretic ailments， and its main secondary metabolites are secoiridiod glycosides represented by gentiopicroside. The biosynthetic pathway of gentiopicroside is via methylerythritol phosphate pathway （MEP） and mevalonate pathway （MVA） pathways. Fosmidomycin and lovastatin are specific inhibitors of 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase （DXR） of the MEP pathway and hydroxymethylglutaryl－CoA reductase （HMGR） of the MVA pathway， and are widely used in the research of the biosynthesis pathway and regulation mechanism of secondary metabolites. The article aims to test and search for the optimal condition for decreasing the contents of four secoiridiod glycosides compounds （loganic acid， sweroside， swertiamarin and gentiopicroside） in G. macrophylla by using the orthogonal test designs. In this study， the concentration of fosmidomycin（A）， concentration of lovastatin（B） and sampling days （C） were taken as three factors， and each factor was taken as four levels to design an orthogonal test， with 16 groups of treatment. HPLC was used to determine the contents of four secoiridiod glycosides， and the data were statistically analyzed. The results were as follows： （1） The contents of the four secoiridiod glycosides compounds in G. macrophylla were most affected by sampling time， followed by fosmidomycin concentration and then lovastatin concentration. （2） After treatment with the optimal inhibitory conditions， the contents of loganic acid， swertiamarin， gentiopicroside and sweroside decreased by 69%， 36%， 33% and 4% respectively. In conclusion， optimal inhibition conditions are determined to be fosmidomycin 400 μmol·L－1， lovastatin 50 μmol·L－1， samples are harvested on six days， which provides the reference for further research on the regulatory mechanism of MEP and MVA pathways in the metabolism and synthesis of secoiridiod glycosides.

Key words： orthogonal test， MVA pathway， MEP pathway， lovastatin， fosmidomycin， secoiridiod glycosides

秦艽是龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）多年生草本植物（彭美晨和艾曉輝，2021），是國家傳統(tǒng)中藥，味辛、苦，性平，歸胃、肝、膽經(jīng)（楊飛霞，2020）。秦艽以根入藥，有祛風(fēng)濕、清濕熱的作用，可以止痹痛、退虛熱，用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、濕熱黃疸、小兒疳積發(fā)熱等（中國藥典2020年版）。秦艽主要含有環(huán)烯醚萜類成分，如龍膽苦苷（gentiopicroside）、獐牙菜苦苷（swertiamarin）、獐牙菜苷（sweroside）、馬錢苷酸（loganic acid）等（楊飛霞，2020）。環(huán)烯醚萜類化合物有廣泛的生物活性，如抗腫瘤和抗炎等（Tundis et al.，2008），龍膽苦苷和獐芽菜苦苷有良好的抗炎鎮(zhèn)痛和保肝作用（吳昕怡和劉小莉，2017；李跟旺和王磊，2018；Muhamad Fadzil et al.，2021）。

萜類化合物的生源合成途徑主要由位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA途徑）和質(zhì)體中的2－甲基赤蘚糖醇－4－磷酸途徑（methylerythritol phosphate pathway，MEP途徑）組成（Hua et al.，2014；Liao et al.，2016）。結(jié)合長春花單萜吲哚生物堿合成途徑的研究（Miettinen et al.，2014）以及秦艽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘（Cao et al.，2016），推測龍膽苦苷的生源合成途徑（康恒等，2021）主要通過MVA和MEP途徑分別合成焦磷酸異戊烯酯（isopentenyl diphosphate，IPP），IPP可異構(gòu)化形成其同分異構(gòu)體焦磷酸二甲基丙烯酯（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），并一起縮合成焦磷酸香葉酯（geranyl pyrophosphate，GPP），GPP再經(jīng)過多步酶促反應(yīng)依次合成馬錢苷酸、馬錢苷、裂環(huán)馬錢苷以及龍膽苦苷，并衍生出獐牙菜苦苷和獐牙菜苷等萜類化合物，而中間的反應(yīng)步驟尚不清楚（Liao et al.，2016; Li et al.， 2022）。

目前，有關(guān)MVA和MEP途徑在代謝產(chǎn)物合成中作用機制備受關(guān)注。膦胺霉素和洛伐他汀分別為MEP途徑1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase，DXR）和MVA途徑HMG－CoA還原酶（hydroxyme－thylglutaryl－CoA reductase，HMGR）的專一抑制劑（魏潔書，2013），被廣泛應(yīng)用于次生代謝產(chǎn)物的生源合成途徑及調(diào)控機制的研究。為了解穿心蓮內(nèi)酯的生物合成途徑，Sinha等（2018）在穿心蓮的懸浮細(xì)胞中添加洛伐他汀和膦胺霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEP和MVA通路受多種水平調(diào)控，DXR和HMGR對穿心蓮內(nèi)酯的貢獻(xiàn)率分別為76.6%和77.6%，這兩種通路對穿心蓮內(nèi)酯的產(chǎn)生都有重要貢獻(xiàn)。劉麗（2012）在人參發(fā)根中添加洛伐他汀和膦胺霉素，通過檢測其次生代謝產(chǎn)物含量推斷人參總皂苷生物合成的主要通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洛伐他汀和膦胺霉素均可抑制人參總皂苷生物合成，并推測MVA途徑在人參皂苷的生物合成中占主要作用。Rather等（2019）在青脆枝的發(fā)根組織中添加膦胺霉素和洛伐他汀，通過評估次生代謝產(chǎn)物含量以及生物合成通路的主要基因的變化，研究MVA和MEP途徑的相互作用，發(fā)現(xiàn)膦胺霉素和洛伐他汀可顯著降低青脆枝的發(fā)根組織中DXR和HMGR的轉(zhuǎn)錄水平，并推測MEP途徑是喜樹堿合成前者的主要供給者。Yang等（2012）和Yang等（2019）在丹參毛狀根中添加洛伐他汀和膦胺霉素，探討MVA和MEP通路在丹參毛狀根細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物積累中的作用，發(fā)現(xiàn)MVA途徑在丹參毛狀根細(xì)胞生長中發(fā)揮著重要作用，而MEP途徑是丹參次生代謝產(chǎn)物含量的積累的主要途徑。但是，有關(guān)MVA和MEP途徑在秦艽次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的作用機制尚缺乏相關(guān)的研究?；诖耍狙芯恳罁?jù)抑制劑膦胺霉素和洛伐他汀的抑制原理，采用3因素4水平正交試驗的方法，通過設(shè)置不同濃度的膦胺霉素和洛伐他汀處理一月生秦艽幼苗，選取不同的取樣天數(shù)，通過評估其次生代謝產(chǎn)物含量的變化，擬篩選可抑制秦艽中馬錢苷酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量的最優(yōu)條件，以期為進(jìn)一步研究秦艽MEP和MVA代謝途徑調(diào)控機制和解析環(huán)烯醚萜類化合物的合成機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器

秦艽種子購自甘肅慶陽正寧縣，于溫室撒播種子給予16 h光照，8 h黑暗處理，覆膜出苗后培養(yǎng)一個月（葉片2對生，高度2 cm左右）用于試驗。LC－20XR分析型高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜柱（Welch，4.6 mm×250 mm，5 μm），精密電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），超聲波清洗儀（小美儀器有限公司），OBS－2100油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試劑

馬錢苷酸（批號：K17S11B124207，純度≥98%）、獐牙菜苦苷（批號：Y25J1G1429，純度≥98%）、龍膽苦苷（批號：Y29A11Q112202，純度≥98%）、獐牙菜苷（批號：P25O10F101344，純度≥98%）、洛伐他汀（批號：Y23D6C7375，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司。膦胺霉素（批號：lX040552，CHEMEGEn公司），甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司），乙腈（上?；裟犴f爾貿(mào)易有限公司），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 溶液配制

稱取0.010 4 g洛伐他汀于50 mL容量瓶中，加入2 mL無水乙醇，混勻后加入20 μL 0.6 mol·L－1的NaOH，靜置30 min，加入適量1 mol·L－1 HCl調(diào)節(jié)pH至7，加純化水定容至50 mL，得500 μmol·L－1的洛伐他汀母液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

稱取0.010 0 g膦胺霉素于50 mL容量瓶中，加純化水定容至50 mL，超聲溶解，得到濃度為546 μmol·L－1的膦胺霉素母液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

稱取馬錢苷酸0.95 mg、獐牙菜苦苷1.26 mg、龍膽苦苷2.52 mg和獐牙菜苷1.24 mg的對照品，加甲醇定容至1 mL容量瓶中，混勻，得到質(zhì)量濃度為馬錢苷酸0.95 mg·mL－1、獐牙菜苦苷1.26 mg·mL－1、龍膽苦苷2.52 mg·mL－1和獐牙菜苷1.24 mg·mL－1的母液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 正交試驗及樣品處理

參照（于淑池，2013；羅云云，2019）按表1的因素、水平進(jìn)行試驗設(shè)計噴施處理16組秦艽幼苗，每組處理30株。處理后放置26 ℃下光照16 h·d－1。取不同處理條件下的幼苗，用純水沖洗干凈幼苗上的土壤和雜質(zhì)，濾紙吸干水分后置于旋蒸瓶中，加入少量甲醇減壓1.5 h抽干水分。將干燥后的秦艽幼苗稱重后加入1.5 mL離心管中，加入1 mL甲醇超聲提取3次，每次1.5 h，過濾得到綠色的提取液，減壓濃縮，得到灰綠色的固體物質(zhì)，黏附在瓶壁，稱重。加入1 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，濾液為樣品溶液。

1.5 HPLC色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

流動相為0.1%磷酸水∶乙腈，洗脫梯度為0～10 min，12%乙腈；10～13 min，10%乙腈；13～30 min，12%乙腈，流速為0.8 mL·min－1，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為30 ℃。

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用甲醇按照倍數(shù)稀釋，制備不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。馬錢苷酸濃度梯度為0.950 0、0.475 0、0.237 5、0.118 8、0.059 4、0.029 7、0.014 9、0.007 5、0.003 8、0.001 9 mg·mL－1；獐牙菜苦苷濃度梯度為1.260 0、0.630 0、0.315 0、0.157 5、0.078 8、0.039 4、0.019 7 mg·mL－1；龍膽苦苷濃度梯度為2.520 0、1.260 0、0.630 0、0.315 0、0.157 5、0.078 8、0.039 4、0.019 7 mg·mL－1；獐牙菜苷濃度梯度為1.240 0、0.620 0、0.310 0、0.155 0、0.077 5、0.193 8、0.009 7、0.004 8、0.002 4 mg·mL－1的對照品溶液，依據(jù)上述色譜條件依次進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣濃度（X，g·mL－1）和峰面積（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。馬錢苷酸的線性回歸方程為Y=4 571 241.60X-11 205.29，線性范圍為0.002 0～0.475 0 g·mL－1；獐芽菜苦苷的線性回歸方程為Y=6 499 223.38X-24 589.43，線性范圍為0.003 0～0.630 0 g·mL－1；龍膽苦苷線性回歸方程為Y=14 344 350.83X-442 328.21，線性范圍為0.005 0～2.520 0 g·mL－1；獐芽菜苷線性回歸方程為Y=6 047 666.40X-40 600.10，線性范圍為0.002 0～1.240 0 g·mL－1。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Minitab 18（Minitab公司）對正交試驗結(jié)果做極差分析，SPSS Statistics 26（IBM公司）對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，運用GraphPad Prism 5（GraphPad公司）軟件作圖。驗證結(jié)果數(shù)據(jù)采用x±s表示。抑制劑對代謝產(chǎn)物的抑制率計算公式：抑制率=（處理組-空白組）/空白組×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 次生代謝產(chǎn)物含量測定結(jié)果分析

從表1和圖1可以看出，除T1（空白組）外，T2至T16處理組馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量變化趨勢類似。與T1相比，不同處理條件下馬錢苷酸的含量均呈降低的趨勢，其中T9、T10、T14處理組的馬錢酸苷含量降低最為顯著，分別降低了83%、81%、79%，與T1組相比有極顯著差異。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，無論是單一抑制劑還是兩個抑制劑共同作用，均可抑制馬錢苷酸的合成且在抑制劑濃度相同的條件下膦胺霉素對馬錢苷酸的抑制率高于洛伐他汀的作用。與T1組相比，不同的是大部分處理條件下獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量均有所降低，其中T4組降低最為顯著，3種代謝產(chǎn)物分別降低了52%、50%、54%，而T2、T5、T12處理組的獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量不降反升。推測引起此結(jié)果的原因可能與代謝途徑酶的活性、酶基因的表達(dá)等響應(yīng)抑制劑的強度存在差異有關(guān)。

2.2 基于正交試驗結(jié)果進(jìn)行多因素方差分析

對正交試驗結(jié)果進(jìn)行多因素方差分析，發(fā)現(xiàn)膦胺霉素和洛伐他汀對秦艽馬錢苷酸、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷中含量的積累均無顯著性影響，僅取樣天數(shù)對馬錢苷酸的含量積累有顯著影響，而對龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量積累均無顯著性影響（表2）。

2.3 相關(guān)性分析

由表3可知，取樣天數(shù)與獐牙菜苦苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與馬錢苷酸、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；馬錢苷酸與獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量呈顯著正相關(guān)；獐牙菜苦苷與龍膽苦苷、獐牙菜苷的含量呈極顯著正相關(guān)；龍膽苦苷與獐牙菜苷含量呈極顯著正相關(guān)。當(dāng)以MEP和MVA途徑的抑制劑膦胺霉素和洛伐他汀處理秦艽幼苗時，可顯著影響馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量，表明洛伐他汀與膦胺霉素可作為研究環(huán)烯醚萜類化合物生源合成途徑代謝調(diào)控機制的有效抑制劑。取樣天數(shù)與代謝產(chǎn)物含量呈負(fù)相關(guān)，表明隨著取樣天數(shù)的延長，代謝產(chǎn)物含量的生成呈降低趨勢。此外，4種環(huán)烯醚萜化合物之間含量變化呈正相關(guān)，推測是抑制劑作用后，代謝流具備連續(xù)響應(yīng)的機制。

2.4 極差分析

由表4可知，影響4種環(huán)烯醚萜類化合物含量的因素由強到弱的順序是取樣天數(shù)＞膦胺霉素濃度＞洛伐他汀濃度；取樣天數(shù)對次生代謝產(chǎn)物含量的影響因素最大，其次是膦胺霉素濃度，洛伐他汀濃度影響最小。

本研究考查抑制劑對秦艽4種環(huán)烯醚萜類化合物含量的影響，關(guān)注引起化合物含量降低的因素，因此根據(jù)極差分析結(jié)果（表4），A（4）B（2）C（4）即膦胺霉素400 μmol·L－1，洛伐他汀50 μmol·L－1，處理6 d為馬錢苷酸的最佳抑制條件；A（1）B（2）C（4）即膦胺霉素0 μmol·L－1，洛伐他汀50 μmol·L－1，處理6 d為獐芽菜苦苷的最佳抑制條件；A（4）B（2）C（4）即膦胺霉素400 μmol·L－1，洛伐他汀50 μmol·L－1，處理6 d為龍膽苦苷的最佳抑制條件；A（1）B（2）C（4）即膦胺霉素0 μmol·L－1，洛伐他汀50 μmol·L－1，處理6 d為獐芽菜苷的最佳抑制條件。綜合考慮，4種代謝產(chǎn)物最佳的抑制條件為A（4）B（2）C（4）即膦胺霉素400 μmol·L－1，洛伐他汀50 μmol·L－1，處理天數(shù)為6 d（圖2）。

2.5 驗證試驗

以正交試驗設(shè)計篩選所得最優(yōu)抑制條件處理秦艽一月生幼苗，重復(fù)3次，檢測其次生代謝產(chǎn)物含量，以驗證最優(yōu)抑制條件的可靠性。驗證試驗結(jié)果表明，與空白組相比，處理組中4種環(huán)烯醚萜的含量均有不同程度的降低，馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷以及獐芽菜苷含量分別下降了69%、36%、33%和4%（表5）。這表明最優(yōu)抑制條件為洛伐他汀50 μmol·L－1、膦胺霉素400 μmol·L－1和取樣天數(shù)6 d。

3 討論與結(jié)論

秦艽作為中國傳統(tǒng)藥材，環(huán)烯醚萜類化合物是其主要的藥用有效成分。該類次生代謝產(chǎn)物的生源合成途徑先經(jīng)MVA和MEP途徑合成焦磷酸香葉酯，再經(jīng)過裂環(huán)等多步酶促反應(yīng)合成龍膽苦苷等萜類化合物（康恒等，2021）。本研究以膦胺霉素濃度、洛伐他汀濃度以及取樣天數(shù)為3個主要因素進(jìn)行了3因素4水平的正交試驗，篩選了可顯著抑制馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的最佳條件。本研究極差分析結(jié)果表明，膦胺霉素對代謝產(chǎn)物含量的抑制效果高于洛伐他汀，推測MEP途徑在秦艽環(huán)烯醚萜類次生代謝產(chǎn)物的合成途徑中起主導(dǎo)作用，與王彩云等（2014）基于對滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測龍膽苦苷生物合成主要來源于MEP途徑，部分來源于MVA途徑的結(jié)論相似。此外，抑制劑對馬錢苷酸的含量降低程度顯著強于獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷，

推測馬錢苷酸可能相較其余3種代謝產(chǎn)物位于代謝通路的上游，因此抑制劑對馬錢苷酸含量的影響最大。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，4種代謝產(chǎn)物含量的變化呈顯著正相關(guān)，推測抑制劑對其代謝流可能具有“級聯(lián)趨同”的調(diào)控作用。但是，取樣天數(shù)和代謝產(chǎn)物含量呈顯著負(fù)相關(guān)，即抑制劑處理時間越長，4種環(huán)烯醚萜含量的呈顯著降低趨勢，而關(guān)于抑制劑對代謝產(chǎn)物影響的最長時效還需進(jìn)一步研究。

基于本研究正交法優(yōu)化的最佳抑制條件為膦胺霉素400 μmol·L－1、洛伐他汀50 μmol·L－1、取樣天數(shù)6 d。在該條件下馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量均有所下降，分別下降了69%、36%、33%和4%。這表明基于正交法篩選的抑制條件可作為進(jìn)一步研究秦艽中主要次生代謝產(chǎn)物MVA和MEP合成途徑調(diào)控機制的最優(yōu)抑制條件。本研究所得最佳抑制條件，為后期研究秦艽環(huán)烯醚萜類化合物生物合成過程MVA和MEP代謝通路的調(diào)控機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李 莉）