胃癌患者血清miR-369、miR-1323水平及其臨床意義

楊思雨,姜淮蕪,姚暉,周航宇,馬波

胃癌已成為全球消化道惡性腫瘤之一,其在我國具有較高發(fā)病率和病死率[1]。目前診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)是以胃鏡活檢為主,此方法費(fèi)用高,耐受性差,因此未成為大規(guī)模篩查胃癌的方法[2]。隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化,胃癌患者呈現(xiàn)出年輕化的趨勢,若不及時診治將嚴(yán)重威脅患者生命健康。近年來,胃癌的診治取得很大進(jìn)展,但胃癌患者預(yù)后效果不佳,因此尋找能夠準(zhǔn)確評估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物對于胃癌患者預(yù)后意義重大[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)屬于短鏈非編碼RNA分子,其與機(jī)體細(xì)胞分化、凋亡等多重生理功能相關(guān),在不同的腫瘤疾病中有著不同的作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),miR-369-3p在甲狀腺濾泡癌組織和肝癌組織中均表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖、生長和轉(zhuǎn)移[6-7]。miR-1323與肺腺癌患者預(yù)后、肺炎支原體肺炎等肺部疾病相關(guān)[8-9]。本研究通過檢測胃癌患者血清miR-369與miR-1323表達(dá)水平,分析二者與臨床病理特征的關(guān)系及對患者預(yù)后的預(yù)測價值,旨在為胃癌患者預(yù)后評估提供新的生物靶標(biāo),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月—2018年3月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科手術(shù)治療的胃癌患者97例為病例組,男49例,女48例,年齡36～74(60.43±10.67)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)20～25(22.36±1.97)kg/m2;另外選擇同期醫(yī)院健康體檢者90例作為健康對照組,男44例,女46例,年齡32～76(60.89±8.35)歲;BMI 20～25(22.54±1.56)kg/m2。2組性別、年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(1600139),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理學(xué)檢查確定為胃癌[10];②首次進(jìn)行胃癌切除手術(shù);③胃癌患者均采用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù)治療,術(shù)后根據(jù)患者病情進(jìn)行輔助化療措施;④臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤者;②有嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟疾病者;③有嚴(yán)重免疫缺陷者;④臨床資料不全者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-369與miR-1323水平檢測:患者于入院后24 h內(nèi)及健康對照組體檢當(dāng)日清晨抽取空腹肘靜脈血5 ml,離心留取血清,置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用TRIzol試劑(購自北京普非生物科技有限公司)提取胃癌患者血清中的總RNA,后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司),取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司,型號 CFX384;熒光定量PCR試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司),qRT-PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min、95℃變性15 s、56℃退火30 s、62℃延伸30 s,共循環(huán)35次。分別以U6為內(nèi)源對照,以2-ΔΔCt法計算miR-369與miR-1323表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成,miR-369上游引物:5’-CTCCTGGTACCTGAA-GGGAGA-3’,下游引物:5’-CTCCAAGGTGACTGA-GATTTGAT-3’;miR-1323上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCA-CA-3’,下游引物:5’-AACGCTTCGAATTTG-CGT-3’;U6上游引物:5’-ATTGGAACGATACAG-AGAAGATT-3’,下游引物:5’-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3’。

1.3.2 隨訪:采用到院復(fù)診或電話等方式對胃癌患者術(shù)后進(jìn)行隨訪,隨訪時間為3年,隨訪率100%,根據(jù)患者隨訪期間生存或者死亡情況,分為預(yù)后良好亞組59例和預(yù)后不良亞組38例。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-369與miR-1323水平比較 病例組血清miR-369表達(dá)顯著低于健康對照組,血清miR-1323表達(dá)顯著高于健康對照組 (P<0.01),見表1。

表1 健康對照組與病例組血清miR-369與miR-1323水平比較

2.2 不同預(yù)后亞組胃癌患者血清miR-369與miR-1323表達(dá)比較 預(yù)后不良亞組患者血清miR-369表達(dá)顯著低于預(yù)后良好亞組,血清miR-1323表達(dá)顯著高于預(yù)后良好亞組(P<0.01),見表2。

表2 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組胃癌患者血清miR-369與miR-1323表達(dá)水平比較

2.3 血清miR-369、miR-1323表達(dá)在胃癌患者不同臨床/病理特征中比較 血清miR-369、miR-1323表達(dá)在不同性別、年齡、基礎(chǔ)病、家族遺傳史、吸煙史、飲酒史等患者比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而在患者不同癌組織的分化程度、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度方面比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

2.4 血清miR-369與miR-1323預(yù)測胃癌患者預(yù)后的價值分析 繪制血清miR-369與miR-1323預(yù)測胃癌患者預(yù)后價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清miR-369、 miR-1323及二者聯(lián)合預(yù)測胃癌患者預(yù)后的AUC為0.704、0.747、0.823,二者聯(lián)合預(yù)測價值優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測(Z/P=2.713/0.006,1.733/0.040),見表4、圖1。

表3 血清miR-369與miR-1323表達(dá)在胃癌患者不同臨床/病理特征中比較

表4 血清miR-369與miR-1323預(yù)測胃癌患者預(yù)后價值分析

圖1 ROC曲線分析血清miR-369與miR-1323對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值

2.5 血清miR-369、miR-1323水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 以胃癌患者miR-369、miR-1323表達(dá)均值0.75、1.27為界限,將患者分為miR-369高表達(dá)亞組63例、miR-369低表達(dá)亞組34例,miR-1323高表達(dá)亞組51例、miR-1323低表達(dá)亞組46例。采用Kaplan-Meier法分析胃癌患者血清miR-369、miR-1323水平與患者預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示,miR-369低表達(dá)亞組患者3年累積生存率(35/63,55.56%)顯著低于miR-369高表達(dá)亞組患者(24/34,70.59%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.974,P=0.046);miR-1323高表達(dá)亞組患者3年累積生存率(21/51,41.18%)顯著低于miR-1323低表達(dá)亞組患者(38/46,82.61%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.315,P<0.001),見圖2。

2.6 多因素Cox回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的因素 以胃癌患者預(yù)后為因變量(預(yù)后不良=1,預(yù)后良好=0),以miR-369(低表達(dá)=1,高表達(dá)=0),miR-1323(高表達(dá)=1,低表達(dá)=0),分化程度(低分化=1,高、中分化=0);TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期=1,Ⅰ+Ⅱ期=0),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1,無=0)、腫瘤直徑(≥5 cm=1,<5 cm=0),浸潤深度(T4=1,T1～T3=0)為自變量進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示miR-369低、miR-1323高、分化程度低、TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度高是胃癌患者預(yù)后不良的危險因素(P<0.05),見表5。

圖2 血清miR-369、miR-1323表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

表5 Cox回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的因素

3 討 論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,該疾病在患者早期不易察覺,到院就診時已是中晚期,治療比較困難,患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險較高,對患者的預(yù)后構(gòu)成嚴(yán)重威脅。根治性切除術(shù)是目前治療胃癌主要方法之一,但部分患者手術(shù)療效欠佳,患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高,5年生存率較低[11]。miRNA是近年來臨床腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn),其作為腫瘤抑制因子或致癌基因發(fā)揮作用,其異常表達(dá)會影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、分化等多種功能,在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-16]。miRNA參與胃癌細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多個過程,有望成為胃癌早期診斷和預(yù)后監(jiān)測的標(biāo)靶因子。

Dong等[17]采用qRT-PCR檢測miR-369-3p在胃癌組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-369-3p水平較正常胃組織顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn),病例組血清miR-369水平顯著低于健康對照組,預(yù)后不良亞組血清miR-369水平顯著低于預(yù)后良好亞組,與既往研究結(jié)果相似,提示血清miR-369參與胃癌的發(fā)生,其低表達(dá)可能促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖,且與患者預(yù)后不良有關(guān)。研究顯示,miR-1323在食管癌組織中呈高表達(dá),并且其表達(dá)與臨床分期、腫瘤直徑、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。孫婧悅等[2]研究發(fā)現(xiàn),miR-1323在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于對照組,經(jīng)ROC曲線分析其對胃癌診斷的敏感度達(dá)100%,AUC為0.908。本研究結(jié)果顯示,胃癌患者血清miR-1323水平顯著高于健康對照組,預(yù)后不良亞組血清miR-1323水平顯著高于預(yù)后良好亞組,其預(yù)測胃癌預(yù)后不良的AUC為0.823,敏感度為0.947,提示miR-1323高表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生,并且與患者的預(yù)后不良關(guān)系密切,可作為胃癌預(yù)后不良的生物靶標(biāo)應(yīng)用于臨床檢測。楊建華等[19]研究發(fā)現(xiàn),較高的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的危險因素。謝興旺等[20]研究發(fā)現(xiàn),TNM分期、分化程度(低分化)是胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素。本研究經(jīng)Cox回歸分析,結(jié)果顯示miR-369、miR-1323、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度是胃癌患者預(yù)后不良的影響因素,與前人研究結(jié)果一致,提示miR-369、miR-1323與胃癌患者預(yù)后及癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述,miR-369在胃癌患者血清中呈低表達(dá),miR-1323呈高表達(dá),二者與患者臨床病理特征相關(guān),聯(lián)合檢測對患者預(yù)后具有良好的預(yù)測價值,并且是患者預(yù)后不良的影響因素。本研究局限在于,納入樣本量較少,后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討miR-369與miR-1323在胃癌患者中的作用機(jī)制,以期為改善胃癌患者的預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊思雨:設(shè)計研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;姜淮蕪:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;姚暉、周航宇:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;馬波:進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析