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    橙花叔醇對膿毒癥急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)及AMPK/SIRT1通路的影響

    2023-05-22 09:42:34薛涵予王澤秀張曉麗
    關(guān)鍵詞:橙花膿毒癥粒細(xì)胞

    薛涵予, 王澤秀, 張曉麗

    (1.普洱市中醫(yī)醫(yī)院肺系病科,云南普洱 665000;2.云南省中醫(yī)醫(yī)院肺病科,云南昆明 650000)

    膿毒癥是由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)所導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1-2]。在膿毒癥中,炎性細(xì)胞被激活并釋放大量炎性介質(zhì),如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)-1和氧自由基等,可導(dǎo)致組織和機(jī)體器官的嚴(yán)重?fù)p傷[3-4]。急性肺損傷是膿毒癥的主要并發(fā)癥之一,是以呼吸衰竭、肺泡-毛細(xì)血管膜屏障、肺水腫和免疫/炎癥反應(yīng)為特征的毀滅性疾病[5]。抑制炎癥反應(yīng)可以減輕膿毒癥急性肺損傷并提高膿毒癥的存活率[6-7]。

    橙花叔醇(3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇,nerolidol,NRD)是一種脂肪族倍半萜醇,存在于生姜、香茅、檸檬草、玫瑰和茶樹等精油中[8],具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌作用[9-12]。既往有研究報道,橙花叔醇可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶和單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2 相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)通路抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷過程中的炎癥反應(yīng)[13]。為進(jìn)一步探討橙花叔醇對膿毒癥急性肺損傷的治療作用及機(jī)制,本研究構(gòu)建膿毒癥急性肺損傷大鼠模型,觀察橙花叔醇對其炎癥反應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn),AMPK 是參與能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激酶,AMPK 通過激活下游效應(yīng)分子在急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[14]。SIRT1(Sirtuin1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性組蛋白脫乙酰酶,具有抗炎和抗凋亡作用[15],AMPK 具有SIRT1依賴性的抗炎活性?;诖?,本研究觀察橙花叔醇是否通過介導(dǎo)AMPK/SIRT1通路對膿毒癥急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用?,F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物取36 只SPF 級健康12 月齡雄性SD 大鼠,體質(zhì)量300 ~350 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2022-0004,使用許可證號:SYXK(滬)2022-0012。

    1.2 藥物、試劑與儀器橙花叔醇(分子式:C15H26O,分子量:222.37,純度:98%)(美國Santa Cruz 公司)。LPS(美國Sigma-Aldrich 公司);AMPK 抑 制 劑Dorsomorphin(美 國R&D Systems 公司);蘇木素-伊紅(HE)染液(上海Beyotime 公司);白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10 和腫瘤壞死因子(TNF)-α(美國R&D Systems 公司); 兔抗磷酸化AMPK(p-AMPK)抗體、兔抗SIRT1 抗體、兔抗GAPDH 抗體(美國Santa Cruz 公司)。BioSystem XA全身體積描記肺功能檢測儀(WBP,美國DSI 公司);血細(xì)胞計數(shù)器(上海契景公司);Eclipse Ci顯微鏡(日本Nikon 公司);Infinite F50 酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司)。

    1.3 分組、造模與給藥將36 只大鼠隨機(jī)分為6 組,分 別 為Sham 組、LPS 組、LPS+DMSO 組、LPS+NRD 組、LPS+NRD+DMSO 組、LPS+NRD+Dors組,每組6只。

    腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)對大鼠進(jìn)行麻醉后,背部臥床固定,分離右股靜脈,對股靜脈進(jìn)行導(dǎo)管注射[16]。

    動物處理具體方法如下。Sham 組:假手術(shù)組,股靜脈注射8 mg/kg 磷酸鹽緩沖液(PBS);LPS 組:通過股靜脈注射LPS 8 mg/kg建立膿毒癥急性肺損傷模型;LPS+NRD 組:橙花叔醇預(yù)處理組,在LPS注射前30 min 尾靜脈注射橙花叔醇100 mg/kg[16];LPS+DMSO 組:橙花叔醇預(yù)處理陰性對照組,在LPS注射前30 min尾靜脈注射5 mg/kg DMSO;LPS+NRD+DMSO 組:尾靜脈注射橙花叔醇100 mg/kg 和5 mg/kg DMSO,然后股靜脈注射LPS 8 mg/kg;LPS+NRD+Dors 組:尾靜脈注射橙花叔醇100 mg/kg 和5 mg/kg AMPK 抑制劑Dorsomorphin[16],然后股靜脈注射LPS 8 mg/kg。

    所有大鼠在LPS誘導(dǎo)24 h后用過量的戊巴比妥鈉800 mg/kg 安樂死,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織。

    1.4 觀察指標(biāo)與方法

    1.4.1 肺功能檢測 LPS 誘導(dǎo)后12 h 后,使用50 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,使用全身體積描記肺功能檢測儀(WBP)進(jìn)行檢查。WBP 由一個壓力傳感器(MAX1320,Buxco Electronics,Sharon,CT)相互連接的參考室和動物室組成。根據(jù)Buxco肺部操作協(xié)議[17-18],測定大鼠用力呼出25% ~75%肺活量時的呼氣流量(FEF25%-75%)和20 毫秒用力呼氣量/用力肺活量(FEV20/FVC)比值。

    1.4.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集和細(xì)胞計數(shù) 將大鼠處死后,使用0.5 mL 無菌PBS 進(jìn)行支氣管肺泡灌洗3 次(總體積=1.5 mL),得到BALF。然后,使用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行總白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)。

    1.4.3 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察肺組織病理學(xué)形態(tài) 將大鼠肺組織樣本用10%福爾馬林溶液固定,包埋在石蠟中,然后切成3 ~4 μm切片。切片先后在二甲苯和乙醇中脫水。然后進(jìn)行HE 染色。通過顯微鏡觀察圖像,并在成像系統(tǒng)(Digital Sight DS-FI2,Nikon,日本)上采集圖像。采用Smith 評分法[19]評估肺損傷程度,肺泡和間質(zhì)炎癥、水腫,肺泡和間質(zhì)出血、壞死,肺不張和透明膜形成均按照0 ~4 分制評分:無損傷,計0 分;損傷小于25%,計1 分;損傷25%~50%,計2 分;損傷50%~75%,計3分;損傷大于75%,計4分。

    1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測BALF 中IL-1β、IL-10和TNF-α的水平 按照IL-1β、IL-10和TNF-α 試劑盒說明書操作,最后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值。

    1.4.5 Western Blot 法檢測肺組織p-AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平 將肺組織均質(zhì)化后,使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。將等量的蛋白質(zhì)(40 mg)加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上,轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,分別與第一抗體兔抗p-AMPK、SIRT1、GAPDH(均按體積比1∶1 000 稀釋)。然后,將膜與第二抗體辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG 一起在室溫下孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光,最后應(yīng)用AlphaEase 軟件分析條帶灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參。

    1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行圖片制作。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。2 組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),事后檢驗均采用Tukey’s 多重比較法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 橙花叔醇改善LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織及肺功能LPS組和LPS+DMSO 組大鼠肺組織可見中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡壁增厚、出血和透明膜形成,LPS+NRD 組肺組織病理表現(xiàn)較LPS+DMSO 組好轉(zhuǎn)。見圖1-A。表明LPS 誘導(dǎo)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織出現(xiàn)明顯炎性損傷,而橙花叔醇(NRD)預(yù)處理可減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織病理損傷。

    圖1 橙花叔醇(NRD)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織及肺功能的影響Figure 1 Effects of nerolidol on lung tissue and lung function in rats with LPS-induced sepsis-associated acute lung injury

    Smith 評分結(jié)果顯示:與Sham 組比較,LPS 組肺組織損傷評分增加(P<0.001);與LPS+DMSO組比較,LPS+NRD 組肺組織損傷評分減少(P<0.01)。見圖1-A。表明橙花叔醇可明顯減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織損傷程度。

    與Sham組比較,LPS組大鼠FEF25%-75%和FEV20/FVC 比值顯著下降(P<0.01);與LPS+DMSO 組比較,LPS+NRD 組FEF25%-75%和FEV20/FVC 比值升高(P<0.01)。見圖1-B、圖1-C。表明橙花叔醇能部分逆轉(zhuǎn)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能的下降。

    2.2 橙花叔醇抑制LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF炎癥反應(yīng)對BALF 中炎癥細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和分類,結(jié)果顯示:與Sham 組比較,LPS 組和LPS+DMSO 組大鼠BALF 中總白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.01 或P<0.001);與LPS+DMSO 組比較,LPS+NRD 組大鼠BALF 中總白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著減少(均P<0.01)。見圖2-A。橙花叔醇可顯著降低膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平。

    圖2 橙花叔醇(NRD)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF炎癥反應(yīng)的影響Figure 2 Effect of nerolidol on the inflammatory response of BALF in rats with LPS-induced sepsis-associated acute lung injury

    TNF-α、IL-1β 和IL-10 為炎癥相關(guān)因子[20]。ELISA 檢測結(jié)果顯示:與Sham 組比較,LPS 組和LPS+DMSO 組大鼠BALF 中TNF-α 和IL-1β 水平顯著上升,IL-10 水平顯著下降(均P<0.01);與LPS+DMSO 組 比 較,LPS+NRD 組 大 鼠BALF 中TNF-α 和IL-1β 水平顯著下降,IL-10 水平顯著上升(均P<0.01)。見圖2-B。表明橙花叔醇可調(diào)節(jié)膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF炎癥因子的釋放。

    2.3 橙花叔醇通過激活A(yù)MPK/SIRT1通路減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠膿毒癥急性肺損傷通過Western Blot 法觀察LPS 誘導(dǎo)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織勻漿中AMPK/SIRT1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與Sham組比較,LPS組肺組織p-AMPK與SIRT1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.01)。見圖3。結(jié)果表明,LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK/SIRT1通路被抑制。

    圖3 脂多糖(LPS)誘導(dǎo)對大鼠肺組織AMPK/SIRT1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of LPS induction on AMPK/SIRT1 pathway-related protein expression in rat lung tissue

    為了確定橙花叔醇是否通過激活A(yù)MPK 發(fā)揮抗炎作用,在使用橙花叔醇治療大鼠膿毒癥急性肺損傷的同時使用AMPK 抑制劑(Dorsomorphin,Dors)來抑制AMPK 磷酸化。結(jié)果顯示:與LPS+NRD+DMSO 組比較,LPS+NRD+Dors 組肺組織p-AMPK 及SIRT1 蛋白表達(dá)水平下降(P<0.01)。見圖4-A。提示Dors 成功抑制了橙花叔醇對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK 磷酸化及SIRT1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。且在Dors 的應(yīng)用下,橙花叔醇減輕的大鼠肺組織病理及功能損傷被逆轉(zhuǎn),表現(xiàn)在肺損傷嚴(yán)重,F(xiàn)EF25%-75%和FEV20/FVC 水平均顯著下降(見圖4-B ~D)。此外,AMPK 抑制劑Dors顯著升高橙花叔醇干預(yù)的BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量及炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平,顯著降低抗炎癥因子IL-10 水平(均P<0.01,見圖4-E、圖4-F)。上述結(jié)果表明,橙花叔醇可通過激活A(yù)MPK/SIRT1通路保護(hù)膿毒癥急性肺損傷大鼠。

    圖4 橙花叔醇(NRD)通過激活A(yù)MPK/SIRT1通路對大鼠膿毒癥急性肺損傷的影響Figure 4 Effect of nerolidol on sepsis-induced acute lung injury in rats through activation of AMPK/SIRT1 pathway

    3 討論

    炎癥被認(rèn)為是對感染或損傷的主要反應(yīng)。然而,炎癥不受控制的延長可導(dǎo)致組織損傷[21-22]。LPS 是急性肺損傷發(fā)生的常見內(nèi)毒素[23]。研究[24-25]發(fā)現(xiàn),LPS 可以顯著上調(diào)中性粒細(xì)胞和單核白細(xì)胞的積累、上調(diào)炎性因子的表達(dá)水平。炎癥浸潤是急性肺損傷的關(guān)鍵因素,它導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性惡化[26]。白細(xì)胞,尤其是中性粒細(xì)胞,是急性肺損傷發(fā)病機(jī)制的“罪魁禍?zhǔn)住薄PS 誘導(dǎo)后,來自肺泡巨噬細(xì)胞和肺細(xì)胞的促炎介質(zhì)會刺激外周循環(huán)中的中性粒細(xì)胞活化[27]。中性粒細(xì)胞的遷移、呼吸爆發(fā)和脫粒對先天免疫系統(tǒng)至關(guān)重要[28]。本研究結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能、肺組織明顯受損,炎性細(xì)胞浸潤明顯,且BALF 中中性粒細(xì)胞和單核白細(xì)胞募集,且伴隨BALF 中TNF-α、IL-1β表達(dá)的顯著升高,抗炎性因子IL-10水平的顯著降低。橙花叔醇可抗炎[29]。給予橙花叔醇預(yù)防干預(yù)后,橙花叔醇可減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織病理損害及肺功能損傷,降低BALF 中總白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水 平,提高BALF 中IL-10水平,上調(diào)肺組織p-AMPK、SIRT1 蛋白表達(dá)水平。表明橙花叔醇可減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)。

    AMPK 是一種廣泛存在于真核生物中的能量敏感性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,對于調(diào)節(jié)能量代謝和線粒體生物發(fā)生以應(yīng)對能量剝奪至關(guān)重要[14];SIRT1 是一種NAD+依賴性組蛋白脫乙酰酶,是參與細(xì)胞能量平衡的代謝酶[15]。既往研究表明,AMPK的敲低明顯加重了LPS 誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥急性肺損傷[30-31]。本研究結(jié)果顯示,LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK/SIRT1 通路被抑制,而橙花叔醇促進(jìn)了膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK 的磷酸化并上調(diào)了SIRT1的表達(dá)。為驗證橙花叔醇是否通過介導(dǎo)AMPK/SIRT1通路對膿毒癥急性肺損傷產(chǎn)生治療作用,本研究在同時添加AMPK 抑制劑的條件下使用橙花叔醇預(yù)處理模型大鼠,發(fā)現(xiàn)橙花叔醇減輕肺損傷的效應(yīng)被部分逆轉(zhuǎn),表明橙花叔醇通過激活A(yù)MPK/SIRT1通路修護(hù)大鼠膿毒癥急性肺損傷。

    綜上所述,橙花叔醇可通過介導(dǎo)AMPK/SIRT1通路及抑制炎癥反應(yīng)對膿毒癥急性肺損傷大鼠發(fā)揮治療作用。

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