苦豆子總堿二元醇脂質(zhì)體制備及體外透皮特性研究*

王慧 邵青 張燕 王文杰 楊苗苗 胡婕雯 張玲

(1.西安市精神衛(wèi)生中心,陜西 西安 710061;2.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院,陜西 西安 710000)

苦豆子[1]為豆科植物苦豆子的種子,是西北很普遍的一種很重要的藥植資源。該品具有清熱去火,抑菌消炎等功效[2],常用于胃痛,宮頸糜爛,濕疹,頑癬等疾病。由于其不易透過皮膚一定程度制約了其外用制劑的開發(fā)與應(yīng)用。

乙醇脂質(zhì)體[3]含有較高濃度乙醇,在傳遞過程中使脂質(zhì)體易變形,較易攜帶藥物進(jìn)入皮膚深層,顯著增加藥物的滲透性,但由于乙醇易揮發(fā),長期放置藥物容易泄漏,很大程度上限制了其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。如果在乙醇脂質(zhì)體制備過程中加入丙二醇[4-5],可能會因?yàn)檎扯仍龃?從而增加乙醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,鑒于此,本實(shí)驗(yàn)在制備乙醇脂質(zhì)體顯著提高苦豆子總堿的透皮量的基礎(chǔ)上,在處方中加入了丙二醇,制備二元醇脂質(zhì)體,并對其包封率、體外透皮率、囊泡進(jìn)入皮膚的深度及穩(wěn)定性進(jìn)行考察,篩選出乙醇與丙二醇的最佳配比。

1 儀器與材料

1.1儀器 LCZA型高效液相色譜儀系統(tǒng)(日本島津);Leica Tcs SpⅡ型激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡有限公司);RC-3B型藥物溶出儀(天津市精拓儀器科技有限公司);TG20M型高速離心機(jī)(湖南郝西儀器設(shè)備有限公司),TK-12B型透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀(上海羅中科技發(fā)展有限公司)。

1.2試藥 苦豆子總生物堿原料藥(批號:040228,含量99.8%,寧夏紫荊花藥業(yè));槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號:040228,食品藥品研究所);卵磷脂(PC上海愛康精細(xì)化工有限公司,含量90%);羅丹明B(Sigama公司);透析袋(截留分子量5000～8000,北京鵬成生物所分裝);甲醇是色譜純(Dima公司)。

1.3動物 昆明種小鼠,體重(20±4)g(許可證號SCXK(甘)14-006,合格證:醫(yī)動字第14-006號,蘭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)。

2 方法

2.1制備二元醇脂質(zhì)體 精密稱取3%(W/V)的苦豆子總堿、3%(W/V)PC和0.03%(W/V)羅丹明B溶于4.5 mL醇溶液中(乙醇∶丙二醇為10∶0,9∶1,7∶3,5∶5,3∶7,1∶9和0∶10,w/w),將PBS(pH 6.5)5.5 mL緩慢注入,整個(gè)過程在密閉恒溫容器中以700 r·min-1的轉(zhuǎn)速不斷攪拌20 min,制備過程中保持體系在(30±1)℃,室溫冷卻30 min,過濾[6],得不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質(zhì)體。

2.2苦豆子總堿中槐定堿的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:三乙胺-甲醇-0.05mol·L-1磷酸二氫鈉(0.1∶20∶80);檢測波長:210 nm;柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密稱取6 mg的槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶液并定容,得對照品。精密量取該對照品,用甲醇將其稀釋成不同濃度的溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 μg·L-1)。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣分析,以峰面積(A)對濃度(C)進(jìn)行回歸,線性回歸方程A=19448C+9811,r=0.9999,表明槐定堿在20～0.625 μg·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3精密度及回收率試驗(yàn) 精密量取槐定堿上述對照品,用甲醇將其稀釋成高、中、低(20、10、5 μg·L-1)的質(zhì)量濃度的對照品溶液,測日內(nèi)精密度(同日測定5次);測日間精密度(連續(xù)測定5 d)[7-8]。結(jié)果,平均日內(nèi)及平均日間均小于5%(n=5),表明該方法精密度良好。計(jì)算樣品溶液的平均回收率為:(99.37±2.31)%,RSD小于2.62%,表明該方法回收率良好。

2.3醇脂質(zhì)體形態(tài)的測定 將制得的二元醇脂質(zhì)體樣品稀釋后,滴至有支持膜的銅網(wǎng)上,磷鉬酸染色后,室溫?fù)]干,透射電鏡下觀察醇脂質(zhì)體形態(tài)。

2.4粒徑及Zeta電位 將制得的二元醇脂質(zhì)體以0.45 μm微孔濾膜過濾,激光動態(tài)光散射儀檢測樣品的粒徑大小及Zeta電位。

2.5包封率的測定 精密量取1 mL苦豆子總堿醇脂質(zhì)體,加無水乙醇,超聲5 min,使醇脂質(zhì)體完全破乳,無水乙醇稀釋到合適濃度,微孔濾膜過濾,HPLC法測定濾液,所測的藥物總濃度為C,將精密量取的等比例的醇相緩沖鹽體系溶液2 mL放于透析袋內(nèi)作為內(nèi)相,將精密量取的苦豆子總堿醇脂質(zhì)體10 mL放于透析袋外作為外相,以500 r·min-1,(35±2)℃透析6 h[9-10]。精密量取1 mL透析袋內(nèi)透析液,用等比例的醇相緩沖鹽溶液稀釋,微孔濾膜過濾,HPLC法測定濾液,所測的游離藥物濃度為CⅠ,計(jì)算不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質(zhì)體的包封率(EE%)為:EE%=(C-CⅠ)/C×100%。

2.6不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質(zhì)體的體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)的比較 采用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行小鼠皮膚的滲透研究,取昆明小鼠,用剃刀小心地刮去背部毛發(fā),從每只被處死的小鼠背部區(qū)域切除一塊皮膚,清洗,浸泡于生理鹽水,4℃保存,備用。給藥室上固定小鼠皮膚,在接收池中加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4),使得小鼠皮膚與接收液完全接觸。取醇脂質(zhì)體各0.5 mL,滴于給藥室上的小鼠皮膚,以500 r·min-1的速度攪拌恒溫水浴池(35±2)℃,分別在0,1,2,3,6,7,10,12,24 h時(shí)間點(diǎn)取0.1 mL接收液,并在接收池中加入0.1 mL磷酸鹽緩沖液。將取得的接收液(0.1 mL)離心(10000 r·min-1)5 min,取1 μL進(jìn)樣,測定含量[11-12]。

2.7觀察小鼠皮膚中醇脂質(zhì)體分布

2.7.1給藥方法 制備含有1%羅丹明B的不同比例乙醇與丙二醇的醇脂質(zhì)體,將醇脂質(zhì)體涂抹于去毛的小鼠皮膚,12 h后,處死小鼠,剝離小鼠皮膚,放于載玻片,備用[13]。

2.7.2共聚焦激光掃描顯微鏡觀測 共聚焦激光掃描顯微鏡對載玻片上的備用皮膚進(jìn)行斷層掃描。結(jié)果見圖3。

2.8醇脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察 分別將制備的醇脂質(zhì)體置于冰箱(4 ℃)及室溫下,每月測定其包封率,不間斷測定3個(gè)月,考察醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[14-16]。

3 結(jié)果

3.1處方篩選 確定處方中乙醇與丙二醇的最佳比例。預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方,當(dāng)苦豆子總堿、醇相和磷脂分別為1%、45%和3%時(shí),苦豆子總堿醇脂質(zhì)體包封率相對最高,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇與丙二醇的配比對粒徑大小及包封率有很大的影響[17-18],對此,本實(shí)驗(yàn)考察乙醇與丙二醇不同比例時(shí)粒徑大小及包封率的變化,結(jié)果見表1和表2。

表1 不同比例的乙醇與丙二醇制備苦豆子總堿醇脂質(zhì)體

表2 不同比例乙醇與丙二醇的苦豆子總堿醇脂質(zhì)體的粒徑、PI、Zeta電位和包封率

3.2醇脂質(zhì)體透射電鏡圖 透射電鏡掃描苦豆子總堿醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3),見圖1。

圖1 醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3)透射電鏡掃描圖(×100000)

圖1可見:醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3)均呈類球形或球形的囊泡。

表1、表2可見:當(dāng)乙醇∶丙二醇=7∶3時(shí),醇脂質(zhì)體粒徑最小(103.00±16.15)nm,包封率最高(89.13±0.42)%,Zeta電位最大(-50.00±6.00)mV。醇脂質(zhì)體粒徑越小,包封率越高,越易攜帶藥物透皮吸收[19],而Zeta電位越大,表明電荷之間排斥越強(qiáng),囊泡間凝聚力[20-23]降低,從而使醇脂質(zhì)體更穩(wěn)定,篩選出乙醇與丙二醇的最佳配比為7∶3。

3.3體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)選用制備的苦豆子總堿醇脂質(zhì)體進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn),其24 h離體皮膚累積滲透曲線見圖2。

從圖2可知,24 h后苦豆子總堿二元醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3)累計(jì)滲透百分?jǐn)?shù)最高,結(jié)果表明:二元醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3)中藥物的滲透性均大于其他乙醇與丙二醇的配比。

3.4共聚焦激光掃描電鏡觀察醇脂質(zhì)體在小鼠皮膚分布 對涂有羅丹明B的不同乙醇與丙二醇的醇脂質(zhì)體小鼠皮膚進(jìn)行斷層掃描,不同比例的乙醇和丙二醇都可以攜帶藥物進(jìn)入皮膚,但圖C較其他圖而言皮膚深層的熒光強(qiáng)度最強(qiáng),這表明醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3)可以增加藥物的透皮量及皮內(nèi)滯留量。結(jié)果見圖3。

3.5苦豆子總堿醇脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察 考察乙醇與丙二醇(7∶3)的醇脂質(zhì)體在室溫下3個(gè)月的穩(wěn)定性,并觀察外觀,粒徑大小和包封率的變化[24]。結(jié)果表明:在室溫下依次于0、1、2、3月末取樣,包封率分別為:89.13%、87.21%、85.06%;粒徑分別為:103.00 nm、109.00 nm、111.00 nm,表明苦豆子總堿醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇=7∶3)的外觀、包封率及粒徑未發(fā)生較大變化,表面醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性良好,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 苦豆子總堿24小時(shí)離體皮膚累計(jì)滲透百分率

注:A.乙醇∶丙二醇10∶0;B.乙醇∶丙二醇9∶1;C.乙醇∶丙二醇7∶3;D.丙二醇5∶5;E.乙醇∶丙二醇3∶7;F.乙醇∶丙二醇1∶9;G.乙醇∶丙二醇0∶10

4 討論

本實(shí)驗(yàn)為獲得含3%的穩(wěn)定的苦豆子總堿醇脂質(zhì)體,減少包封后的滲漏,在乙醇脂質(zhì)體中加入不同比例的丙二醇,考察其體外穩(wěn)定性和透皮試驗(yàn)。最后選擇乙醇與丙二醇的比例為7∶3,因?yàn)樗哂凶罡叩陌饴?89.13±0.42)%、較小的粒徑(103.00±16.15)nm、較小的PI(0.19±0.51)和最高的Zeta電位(-50.00±6.00)mV。囊泡越小,包被率越高,包被的藥物越容易通過皮膚?？喽棺涌倝A醇脂質(zhì)體具有緩釋作用,這可能是因?yàn)榭喽棺涌倝A在通過透析袋進(jìn)入PBS之前要先穿透磷脂雙分子層,使苦豆子總堿緩慢而持續(xù)地釋放。為了研究醇脂質(zhì)體在皮膚中的分布,目前有關(guān)醇脂質(zhì)體的透皮機(jī)制研究主要采用熒光標(biāo)記法,所用的磷脂熒光標(biāo)記物為羅丹明B,其中熒光團(tuán)通過化學(xué)鍵合與磷脂直接鍵合,通過觀察羅丹明B在小鼠體內(nèi)的滲透情況,可以推測二元醇脂質(zhì)體對皮膚的滲透程度[25],在激光共聚焦顯微鏡下觀察了小鼠皮膚外用羅丹明B醇脂質(zhì)體24后皮膚各層熒光強(qiáng)度,從而對二元醇脂質(zhì)體的透皮情況進(jìn)行客觀評價(jià),實(shí)驗(yàn)表明,乙醇∶丙二醇7∶3時(shí),羅丹明B透皮量和透皮深度最大。因此,考慮到含醇脂質(zhì)體(乙醇∶丙二醇7∶3)的穩(wěn)定性、較高的包封率、藥物的透皮百分比和穿透深度,乙醇與丙二醇7∶3的比例為醇脂質(zhì)體處方的最佳配比。