利用纖維素酶水解堿處理稻草生產(chǎn)葡萄糖

顧天華,曹亞群,李烜琦,任曉冬

(1.吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,長春130012; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)城鄉(xiāng)人居環(huán)境發(fā)展促進中心,呼和浩特 010020)

木質(zhì)纖維素是一種豐富的自然資源,全球每年產(chǎn)量超過兩千億噸,但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,難以降解利用.目前,大部分的木質(zhì)纖維素以焚燒和堆積等方式處理,不但浪費資源,而且污染環(huán)境[1].木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3種成分組成,其中半纖維素和木質(zhì)素相互纏繞,將纖維素包裹,形成結(jié)晶結(jié)構(gòu),這種復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)使木質(zhì)纖維素不易降解.為利用木質(zhì)纖維素,需先破壞木質(zhì)纖維素的晶體結(jié)構(gòu),再用纖維素酶降解[2].目前,對木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法等[3].稻草中的主要成分為木質(zhì)纖維素.本文采用NaOH對稻草進行預(yù)處理,分別用掃描電鏡(SEM)、Fourier變換紅外光譜(FTIR)和 X射線衍射(XRD)對預(yù)處理的稻草進行分析,研究NaOH預(yù)處理對秸稈結(jié)構(gòu)的影響,并利用纖維素酶水解預(yù)處理稻草生產(chǎn)葡萄糖,為利用稻草生產(chǎn)生物化工產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ).

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

ZQLY-180V型立式全溫震蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司); SP-722E型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司); HH-6A型恒溫水浴鍋(上海皓莊儀器有限公司); KYKY-EM3900型掃描電子顯微鏡(北京中科科儀股份有限公司); Nicolet 6700型Fourier紅外光譜(美國,Thermo Fisher公司); Empyrean型X射線晶體衍射儀(荷蘭,PANalytical B V公司); TGA PT1000型熱重分析儀(上海林賽斯科學(xué)儀器有限公司).

PDL培養(yǎng)基: 土豆洗凈去皮,切成小塊,取200～300 g熬汁,用8層紗布過濾出汁液,加入葡萄糖20 g,用去離子水定容至1 000 mL.

產(chǎn)酶培養(yǎng)基: 配制含蛋白胨3 g/L,酵母提取物0.5 g/L,KH2PO43 g/L,(NH4)2SO42 g/L,尿素0.3 g/L,MgSO40.3 g/L,CaCO35 g/L,氣爆秸稈30 g/L的溶液,調(diào)節(jié)溶液pH=5.5.

1.2 纖維素酶制備

從土壤中分離純化一株產(chǎn)纖維素酶的菌株AspergillusnigerQ7.將A.nigerQ7接種到40 mL PDL培養(yǎng)基中,于30 ℃,130 r/min條件下培養(yǎng)3 d.再按5%接種量接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,于30 ℃,130 r/min條件下培養(yǎng)5 d.將發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min,棄沉淀,收集上清液為粗酶液.

1.3 纖維素酶純化

利用70%相對飽和度的(NH4)2SO4進行沉淀,于4 ℃鹽析2 h后,于4 ℃,8 000 r/min離心30 min,棄上清液.使用少量緩沖液(pH=5.0)溶解沉淀,于4 ℃保存.將獲得的酶轉(zhuǎn)移至透析袋中(相對分子質(zhì)量截留10 000),透析除鹽,4 ℃保存?zhèn)溆肹4].

1.4 酶活力測定

采用濾紙酶活測定法[5]測酶活力.濾紙酶活力定義為: 在溫度50 ℃,pH=4.8條件下,每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg還原糖所需的酶量,定義為一個酶活力單位(U).

1.5 稻草預(yù)處理

將30 g稻草粉末加入500 mL藍蓋瓶中,加入質(zhì)量分數(shù)為1%的NaOH溶液300 mL,用雙層牛皮紙包扎,放入高壓滅菌器中,于121 ℃反應(yīng)60 min.待反應(yīng)液降至室溫后取出,用8層紗布過濾預(yù)處理液,用蒸餾水反復(fù)洗滌預(yù)處理后的稻草,室溫下晾干,于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.6 預(yù)處理稻草的SEM分析

用SEM對預(yù)處理稻草表面形貌進行分析.取少量預(yù)處理后的稻草,在樣品臺上固定雙面導(dǎo)電膠帶,于真空條件下進行鍍金處理.待樣品表面均勻鍍上一層導(dǎo)電膜后,將樣品置于掃描電子顯微鏡下,在10 kV和15 mA下,放大400倍和 2 000倍進行觀察.

1.7 預(yù)處理稻草的FTIR分析

取預(yù)處理后的稻草,與溴化鉀以1∶100的質(zhì)量比混勻,用瑪瑙研缽研磨至粉末狀,取少量樣本在壓片機上制成薄片.利用Fourier紅外光譜儀進行分析,掃描波長范圍為400～4 000 cm-1,光譜分辨率為4 cm-1,單一樣品進行50次掃描.

1.8 預(yù)處理稻草的XRD分析

取預(yù)處理樣品用X射線衍射儀進行結(jié)晶度分析.對預(yù)處理稻草進行掃描,工作電壓和電流分別為40 kV和40 mA,掃描范圍(2θ)為5°～40°,掃描速度2°/min.樣品結(jié)晶度(ICr)通過

(1)

計算,其中I002為纖維素結(jié)晶區(qū)衍射角的峰值,Iam為無定形區(qū)衍射角的峰值.

1.9 稻草成分分析

按照美國國家可再生能源實驗室(NREL)的LAP002,003,004方法進行分析[6].

1.10 利用纖維素酶降解預(yù)處理前后的稻草

向20 mL的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=5)中分別加入50 mg預(yù)處理前后的稻草,按20 U/g纖維素加入纖維素酶,于50 ℃水浴振蕩,分別在12,18,24,30,36 h取樣,利用葡萄糖試劑盒法測量葡萄糖的質(zhì)量濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理前后稻草的成分分析

按照NREL方法對預(yù)處理前后的稻草進行成分分析,結(jié)果列于表1.由表1可見,經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%NaOH預(yù)處理的稻草,木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)降低,有助于纖維素酶吸附到纖維素上,從而促進纖維素降解成葡萄糖.

表1 預(yù)處理前后稻草的成分分析Table 1 Component analysis of rice straw before and after pretreatment %

2.2 SEM分析結(jié)果

用SEM觀察預(yù)處理前后稻草的結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖1所示.由圖1(A),(B)可見,未處理的稻草表面結(jié)構(gòu)平整光滑.經(jīng)NaOH預(yù)處理后,稻草表面結(jié)構(gòu)被破壞,出現(xiàn)孔洞,纖維斷裂彎曲,表明天然木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)被破壞.可見堿預(yù)處理可有效降解植物細胞壁中的木質(zhì)素[7].稻草中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素纏繞在一起,形成緊湊結(jié)構(gòu),去除木質(zhì)素可大幅度提高纖維素的降解率[8].

圖1 預(yù)處理前后稻草的SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM images of rice straw before and after pretreatment

2.3 FTIR結(jié)果分析

利用FTIR分析預(yù)處理前后的稻草,結(jié)果如圖2所示.由于稻草為混合物,本文以羥基的O—H伸縮振動3 410 cm-1為強度標度歸一化比較其他吸收帶.由圖2可見: 3 300～3 500 cm-1處振動來自羥基的O—H伸縮振動模式,其強吸收和較寬的吸收帶表明稻草分子內(nèi)或分子間可能產(chǎn)生了氫鍵[9]; 2 848,2 916 cm-1處的吸收帶為亞甲基的對稱伸縮和不對稱伸縮振動吸收峰,相比于羥基峰,預(yù)處理后明顯少于預(yù)處理前稻草的亞甲基含量,這可能是因為部分纖維素的糖環(huán)在處理后被打開; 1 728 cm-1處的吸收帶為羰基碳氧雙鍵的伸縮振動[10],與羥基相比,預(yù)處理后明顯比預(yù)處理前稻草羰基的含量增多,預(yù)處理前稻草在1 251 cm-1(羧基或酯羰基的碳氧單鍵伸縮振動)處未出現(xiàn)吸收峰,但處理后的稻草在該處出現(xiàn)了吸收峰,推斷羰基可能來自纖維素糖環(huán)打開后,亞甲基氧化為羧基,部分亞甲基被氧化成了羧酸; 1 621,1 531 cm-1處的峰是苯環(huán)的碳碳雙鍵伸縮振動峰,是木質(zhì)素特征峰,由于處理后僅失去部分木質(zhì)素,因此該峰仍存在于FTIR中.

2.4 XRD分析結(jié)果

木質(zhì)纖維素中有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū).結(jié)晶度是木質(zhì)纖維素聚集形成結(jié)晶程度的指標[11].對預(yù)處理前后的稻草進行X射線晶體衍射分析,并計算結(jié)晶度,結(jié)果如圖3所示.經(jīng)NaOH預(yù)處理的稻草結(jié)晶度為43.36%,而未預(yù)處理的稻草結(jié)晶度為18.51%.這是由于預(yù)處理后,木質(zhì)纖維素的非結(jié)晶成分溶出,導(dǎo)致稻草整體的結(jié)晶度升高[12].

圖2 預(yù)處理前后稻草的FTIRFig.2 FTIR of rice straw before and after pretreatment

圖3 預(yù)處理前后稻草的XRD譜Fig.3 XRD patterns of rice straw beforeand after pretreatment

2.5 利用纖維素酶酶解預(yù)處理前后稻草的結(jié)果

圖4 A.niger Q7 纖維素酶水解預(yù)處理前后 稻草生產(chǎn)葡萄糖的時間進程曲線Fig.4 Time course curves of glucose production fromrice straw before and after pretreatmentwith A.niger Q7 cellulase hydrolysis

利用A.nigerQ7纖維素酶分別水解預(yù)處理前后稻草,水解時間分別為12,18,24,30,36 h.預(yù)處理前后稻草水解產(chǎn)生葡萄糖的質(zhì)量濃度如圖4所示.由圖4可見,水解預(yù)處理后稻草的葡糖糖產(chǎn)量始終高于水解預(yù)處理前稻草的葡萄糖產(chǎn)量[13].

綜上所述,本文用質(zhì)量分數(shù)為1%的NaOH對稻草進行預(yù)處理,稻草中纖維素質(zhì)量分數(shù)從37.40%提高至58.87%,半纖維素質(zhì)量分數(shù)為24.39%,木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)為15.30%.對預(yù)處理前后的稻草進行分析,SEM結(jié)果表明,預(yù)處理后的稻草表面出現(xiàn)塌陷,纖維斷裂彎曲,木質(zhì)纖維素原有的結(jié)構(gòu)被破壞; XRD結(jié)果表明,預(yù)處理后稻草的結(jié)晶度大幅度提高.用從土壤中分離純化的A.nigerQ7產(chǎn)生的纖維素酶水解稻草,預(yù)處理稻草比未預(yù)處理稻草產(chǎn)生葡萄糖的質(zhì)量比提高了47.5%.結(jié)果表明,預(yù)處理稻草中的木質(zhì)素被降解,稻草結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,水解效率顯著提高.因此,先用NaOH預(yù)處理稻草,再用纖維素酶水解稻草生產(chǎn)葡萄糖是稻草利用的有效方式.