氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定砂仁中31 種禁用農(nóng)藥殘留量

◎ 黃小龍，馬恩耀，孔 箭，方達鋒，羅文英，周勁松

（廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510000）

砂仁為藥食兩用中藥材，是姜科植物陽春砂（Amomum villosumLour.）、綠殼砂（Amomum villosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen） 或 海 南 砂（Amomum longiligulareT.L.Wu）的干燥成熟果實[1]。研究發(fā)現(xiàn)，砂仁的主要成分為乙酸龍腦酯、橙花叔醇等[2]。其中，乙酸龍腦酯具有止瀉、鎮(zhèn)痛等功效。陽春砂中乙酸龍腦酯的相對含量為59.60%，是綠殼砂或縮砂的4 倍多，因此陽春砂仁的藥效成分最高，中醫(yī)臨床用藥也以陽春砂仁為主[3]。

陽春砂仁臨床治療效果突出，且為藥食同源藥材，每年市場需求量超2 200 t。陽春砂仁的種植面積逐漸擴大，如云南省陽春砂仁栽培面積由6 500 hm2增至8 613 hm2，約占全國種植總面積的64%[4]；再如陽春全市陽春砂仁種植面積由2017 年的逾1 333 hm2到2020 年的2 980 hm2。而在種植過程中農(nóng)藥的使用不可避免，有機氯與有機磷類農(nóng)藥因具有殺蟲廣譜、高效等特點而被廣泛使用，氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種合成農(nóng)藥，作為殺蟲劑、除草劑和殺菌劑，應(yīng)用也十分廣泛[5]。農(nóng)藥殘留定量檢測意義重大。

因為農(nóng)藥殘留的痕量以及基質(zhì)（樣品中被分析物以外的組分）的復(fù)雜性，所以需要通過建立一種快速、準確、高效和靈敏的前處理方法，將農(nóng)藥從基質(zhì)中分離出來。現(xiàn)代應(yīng)用中農(nóng)藥殘留檢測的前處理技術(shù)主要是超臨界流體萃取和QuEChERS 等技術(shù)。QuEChERS技術(shù)只吸附溶液中的干擾基質(zhì)，而對待測目標化合物保留不吸附，該法主要使用的凈化吸附劑有N-丙基乙二胺（Primary Secondary Amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（Graphitized Carbon Blacks，GCB）、氨丙基粉和氧化鋁粉等[6]。本研究建立QuEChERS-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜農(nóng)藥殘留分析方法，對10 批陽春砂仁藥材進行31 種禁用農(nóng)藥的殘留量的檢測，方法具有良好的靈敏度、準確度和精密度，且線性良好，保證陽春砂仁藥材符合《中國藥典》的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

陽春砂仁藥材由廣州白云山中藥飲片有限公司提供，10 批陽春砂仁樣品具體編號以及產(chǎn)地見表1。

表1 10 批陽春砂仁藥材編號產(chǎn)地表

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

TGL-20R 醫(yī)用離心機（山東百歐）；Raykol-AuToEVA 自動氮吹儀（安譜）；8890-7000D 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫）；渦旋儀（EOAA-VM-B）；Comfort I 超純水機（賽多利斯）；數(shù)字可調(diào)型瓶口分液器（BDAND）。

1.2.2 試劑

31 種禁用農(nóng)藥混合對照品溶液（對照品溶液濃度見2020 年版《中國藥典》）；磷酸三苯酯；冰醋酸（優(yōu)級純）；提取鹽；分散固相萃取凈化管DIKMA；甲酸銨（色譜純）；異丙醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）。

1.3 溶液配制

①0.1%甲酸溶液（含5 mol·L-1甲酸銨）的配制。取甲酸銨0.319 5 g，置于1 000 mL 容量瓶中，加入0.1%甲酸溶液至刻度。②乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mol·L-1甲酸銨）（95 ∶5）的配制。取0.1%甲酸溶液（含5 mol·L-1甲酸銨）50 mL，置于1 000 mL 容量瓶中，加入乙腈定容至刻度。③1%冰醋酸溶液的配制。量取冰醋酸10 mL，加入超純水至1 000 mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 待測農(nóng)藥物質(zhì)及定量限

31 種禁用農(nóng)藥及定量限見表2。

表2 31 種禁用農(nóng)藥定量限表

1.4.2 工作溶液配制

①內(nèi)標溶液的配制。取磷酸三苯酯對照品0.1 mL，精密量取，置于10 mL 容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度。②混合對照品溶液的配制。精密量取31 種農(nóng)藥混合標準溶液0.25 mL，置于10.00 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。③工作溶液的配制。將混合對照品溶液稀釋5 倍，即為工作溶液。④空白基質(zhì)溶液的配制。取空白基質(zhì)樣品，同樣品制備過程制備，作為空白對照曲線。⑤基質(zhì)混合對照溶液的配制。分別精密吸取空白基質(zhì)溶液1.0 mL（6 份），40 ℃氮吹濃縮至約0.4 mL，分別加入工作溶液l0 μL、20 μL、50 μL、l00 μL、150 μL 和200 μL，加乙腈定容至l mL，渦旋混勻，即得。

1.4.3 樣品前處理

取砂仁藥材樣品粉碎過3 號篩，得樣品粉末，精密稱定3 g，置于50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，使用渦旋儀渦旋，使藥粉與溶液充分混合、浸潤，靜置30 min，用移液器精密加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500 次/min）5 min，置于冰箱冷卻10 min，加入提取鹽——無水硫酸鎂與無水硫酸鈉的混合粉末（4 ∶1）7.5 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500 次/min）3 min，離心機離心（5 500 r·min-1）5 min，取上清液9 mL，置預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg和石墨化碳黑90 mg）中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500 次/min）5 min 使凈化完全，離心（5 500 r·min-1）5 min，用移液槍精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上40 ℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋定容至1.0 mL，渦旋混勻，過濾膜，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

1.4.4 測定

分別精密吸取基質(zhì)混合對照溶液和供試品溶液各1 mL，精密加入內(nèi)標溶液0.3 mL，混勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1 μL，注入氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標標準曲線法計算。

1.4.5 儀器條件

（1）氣相色譜條件。氣相色譜柱：VF-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣體積1 μL，進樣口為恒壓進樣模式，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；載氣為高純氦氣（He）；離子源溫度250 ℃；柱溫250 ℃；柱前壓146 kPa；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，再以10 ℃·min-1的速率升溫至160 ℃，再以2 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃，最后以15 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃，保持6 min。

（2）質(zhì)譜條件。以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度250 ℃；碰撞氣為氮氣；質(zhì)譜傳輸接口溫度250 ℃；質(zhì)譜監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標準曲線

基質(zhì)混合對照溶液進樣，經(jīng)儀器測量，以基質(zhì)混合對照溶液峰面積/內(nèi)標溶液峰面積為縱坐標，以基質(zhì)混合對照溶液濃度/內(nèi)標溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，農(nóng)藥化合物以S/N≥3 對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，以S/N≥10 對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果見表3。31 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)為0.985 4 ～0.999 8，線性關(guān)系良好，檢出限為0.000 1 ～0.001 2 mg·kg-1，檢出限低，說明其靈敏度高。

表3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法下31 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)、線性方程、檢出限、定量限表

2.1.2 加標回收率與精密度試驗

向空白樣品基質(zhì)中加入低、中、高3 個水平濃度的混合農(nóng)藥標準溶液，重復(fù)測定3 次，計算回收率及相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表4。試驗結(jié)果顯示，31 種農(nóng)藥的加標回收率為62.62%～97.70%，RSD 為0.62%～10.61%，說明方法的準確性和精密度良好，能滿足31 種農(nóng)藥殘留的檢測要求。

表4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定31 種農(nóng)藥的回收率和RSD 表

2.1.3 重復(fù)性試驗

按照儀器分析條件和樣品前處理方法，精密稱取同一樣品8 份，進行平行實驗，分別計算RSD 值，結(jié)果見表5。試驗結(jié)果表明，RSD 為0.1%～2.9%，均＜3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2 樣品測定

10 批陽春砂仁樣品制備：各取砂仁樣品粉末（過三號篩）精密稱定3 g，平行兩份，分別為A 樣、B 樣，按樣品前處理方法進行處理。通過氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定陽春產(chǎn)地的10 批砂仁藥材的31 種禁用農(nóng)藥殘留量均為未檢出，表明收集的10 批砂仁藥材質(zhì)量良好，產(chǎn)地種植管理規(guī)范。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

QuEChERS 法是一種基于固相萃?。⊿olid Phase Extraction，SPE）的樣品前處理技術(shù)，可有效避免液-液分配中出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象，減少有機溶劑用量，縮短前處理時間[7]。氣質(zhì)聯(lián)用儀當前已被用于分離、鑒定復(fù)雜組分，其綜合了氣相色譜分辨率高和質(zhì)譜靈敏度高的特點，可定性定量分析藥物與代謝物[8-9]。QuEChERS 方法與固相萃取法、液液萃取法相比，方法操作簡單、使用毒性有機試劑少，可避免固相微萃取法和攪拌棒吸附萃取技術(shù)的高成本、樣品易殘留、纖維性脆等缺點[10]。

3.2 提取溶劑的選擇

QuEChERS 法常以乙酸乙酯、丙酮及甲醇為提取劑提取有效成分。丙酮揮發(fā)性強，分離效果差，回收率較低；乙酸乙酯適用于提取弱極性的化合物；甲醇常作為輔助提取試劑，與乙酸乙酯或其他溶液結(jié)合使用。乙腈是目前使用較多的方法，對多種極性較寬的化合物提取效果好，回收率集中在70%～120%。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由非基體影響的試樣所產(chǎn)生的反應(yīng)數(shù)值增加或降低的一種情況[10]。土壤中的底物作用對土壤中的農(nóng)藥殘留有很大的作用，要徹底去除土壤中的底物作用非常困難。農(nóng)藥殘留含量測定中，由于農(nóng)藥種類繁多，在氣相-串聯(lián)質(zhì)譜中加入磷酸三苯酯，可進一步減少底物的作用。

4 結(jié)論

本實驗運用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定10 批陽春砂仁中31 種禁用農(nóng)藥殘留量。實驗對該方法進行了方法學(xué)驗證，考察了準確度、精密度、檢測限、線性范圍，結(jié)果表明氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法高效、靈敏、穩(wěn)定、簡單、快速、經(jīng)濟，適用于砂仁的農(nóng)藥殘留快速檢測。來自廣東陽春的10 批砂仁藥材中，31 種禁用農(nóng)藥檢測結(jié)果均為未檢出，表明產(chǎn)地種植管理規(guī)范，藥材安全性高。