超高壓液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測雞蛋中氯霉素的殘留量

◎ 張貴會，金 定，高友漢，王海彬，李文欣，張 波，王 楠

（扎魯特旗市場檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 通遼 029100）

氯霉素屬于酰胺醇類廣譜抗生素，其對多數(shù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有良好的抑制作用，廣泛用于畜禽及水產(chǎn)動物傳染疾病的預(yù)防和治療[1-3]。但氯霉素殘留對人體的骨髓造血功能有抑制作用，可引起再生障礙性貧血。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中規(guī)定氯霉素（Chloramphenicol）及其鹽、酯是食品動物中禁止使用的藥品[4]。雞蛋含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和人體所需要的微量元素，已經(jīng)成為人們生活中必備的食品之一。但由于一些養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用氯霉素等獸藥，近年來雞蛋中也經(jīng)常檢出氯霉素殘留[5-7]，嚴(yán)重威脅人們的生命健康安全。

目前氯霉素的檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[8]，氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、膠體金免疫層析法[12]，這些檢測方法主要應(yīng)用于牛奶、蜂蜜、可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品，但雞蛋中氯霉素的檢測方法沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)在GB/T 22338—2008[13]和DB37/T 3118—2018 標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，樣品經(jīng)乙酸乙酯和乙腈提取，乙腈復(fù)溶，正己烷除脂，經(jīng)Thermo C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以水乙酸銨溶液和乙腈乙酸銨溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧負(fù)離子模式，選擇反應(yīng)離子監(jiān)測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。本方法操作簡便，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，適合大批量雞蛋中氯霉素殘留量的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo 超高壓液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀FR-5299（通遼玻璃生化儀器廠）；電子天平MS105DU（上海梅特勒儀器有限公司）；固相萃取裝置（南京萊伯特瑞儀器有限公司）；超純水機(jī)（成都優(yōu)普有限公司）；RDE-1 高速勻漿機(jī)（江蘇儀器有限公司）；TGL20M醫(yī)用低溫離心機(jī)（凱達(dá)儀器有限公司）；ORN-II 氮吹儀（上海歐讓科技有限公司）。

氯霉素（甲醇溶劑100 μg·mL-1，批號A21060395，北京壇墨質(zhì)檢）；氯霉素D5（甲醇溶劑100 μg·mL-1，批號A21070082，北京壇墨質(zhì)檢）；LC-Si 硅膠小柱（500 mg/3 mL，美國waters 公司）；C18固相萃取小柱（500 mg/3 mL，美國waters 公司）；乙腈、甲醇（美國Thermo 有限公司）；碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸乙酯、正己烷和乙酸銨，均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：稱取氯霉素D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成500 ng·mL-1的使用液。精密量取100 μg·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇配制成氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液。精密吸取1.0 μg·mL-1的氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)中間液并加入一定量的內(nèi)標(biāo)氯霉素D5使用液，用空白樣品提取液稀釋定容100 mL，配制成濃度為0.110 ng·mL-1、0.510 ng·mL-1、1.000 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1和10.000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，系列溶液中含內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng·mL-1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.2 mL·min-1。流動相：A 為水乙酸銨溶液，B 為乙腈乙酸銨溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；噴霧電壓：2 500 V；檢測方式：選擇離子監(jiān)測（SRM）；噴霧溫度：350 ℃；離子源傳輸管：270 ℃；碰撞氣壓力：1.5 mTorr；輔助氣流速：15 arb；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 氯霉素和氯霉素-D5 特征離子參考質(zhì)譜條件表

1.2.4 樣品前處理

稱取混勻雞蛋樣品5.0 g，于50 mL 塑料離心管中。準(zhǔn)確加入100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液0.1 mL，加入20 mL 乙酸乙酯，2.00 mL 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。均漿提取5 min，8 000 r·min-1離心5 min，將上層溶液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，于殘渣中加入20 mL 乙腈重復(fù)提取，合并2 次提取液于雞心瓶中真空減壓濃縮至干。殘渣用2 mL 乙腈復(fù)溶，同時加入10 mL 正己烷去脂，渦旋混勻。分取乙腈層，正己烷層復(fù)加入2 mL 乙腈萃取，分取乙腈層，合并兩次乙腈層于同一離心管中，于50 ℃氮吹至干。用1.00 mL 水復(fù)溶殘渣，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用Thermo C18色譜柱，比較了《蜂蜜中氯霉素殘留量的測定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 18932.19—2003）、《動物源食品中氯霉素殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部781 號公告-2-2006）和《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）3 種方法的流動相。選擇水-乙腈和甲醇-水作流動相時，氯霉素出峰時間較早，易受溶劑峰和雜質(zhì)峰干擾，從而影響定性定量結(jié)果。而乙酸銨水溶液和乙腈乙酸銨溶液作為流動相梯度洗脫，氯霉素和氯霉素-D5保留時間分別為4.00 min 和3.99 min，峰形對稱，峰形效果較好。氯霉素和氯霉素-D5的選擇反應(yīng)離子監(jiān)測圖見圖1。由圖1 可知氯霉素和氯霉素-D5定量離子和定性離子出峰時間穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好。

圖1 氯霉素和氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ng·mL-1）的選擇反應(yīng)離子監(jiān)測圖

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

氯霉素為弱極性物質(zhì)，在有機(jī)溶劑中有較強(qiáng)的保留。本文提取方法參考楊潔等[14]和許珊珊等[15]采用的純乙酸乙酯、純乙腈、乙酸乙酯和乙腈共同提取，對氯霉素提取效率進(jìn)行考察。除提取溶劑外其他條件均相同，向雞蛋中分別添加1.0 ng·mL-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種基質(zhì)3 次平行，3 種基質(zhì)的回收率見表3。由表3 可見，采用乙酸乙酯+乙腈進(jìn)行提取的效果要優(yōu)于乙酸乙酯和乙腈的單獨(dú)提取效果，使用乙酸乙酯+乙腈復(fù)合溶劑提取可有效提高回收率，降低溶劑的基質(zhì)效應(yīng)，故本研究選取乙酸乙酯和乙腈復(fù)合提取溶劑，內(nèi)標(biāo)法定量，可有效減少基質(zhì)干擾，增加氯霉素的提取率，保證方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。

表3 不同提取溶劑的提取效果表

2.3 凈化方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了LC-Si 硅膠小柱、C18固相萃取小柱及不過柱直接乙腈復(fù)溶正己烷除脂實(shí)驗(yàn)方法。雞蛋液基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)及脂類含量高，LC-Si 硅膠小柱對樣品除雜效果不好，經(jīng)過LC-Si 硅膠小柱的樣液進(jìn)入質(zhì)譜會造成質(zhì)譜離子源和離子傳輸管污染。雞蛋液蛋白質(zhì)和脂肪含量高，C18硅膠小柱容易被樣液堵塞，耗時較長，使實(shí)驗(yàn)難以繼續(xù)。固相萃取柱為較昂貴的實(shí)驗(yàn)耗材，且需要活化洗脫，對實(shí)驗(yàn)操作人員素質(zhì)要求高。綜合考察，選擇不過柱乙腈復(fù)溶正己烷除脂，氯霉素的回收率高，樣品雜質(zhì)較少，操作簡便，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間提高工作效率，適合大批樣品檢驗(yàn)。

2.4 校準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

用1.2.1 的方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在最優(yōu)液相質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，以氯霉素濃度X為橫坐標(biāo)，以氯霉素峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.110 ～10.000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，方程為Y=62 102.1X，相關(guān)系數(shù)（R2）等于0.999 9，可用于準(zhǔn)確定量檢測氯霉素的含量。結(jié)合本方法的前處理方法，以S/N=3 計算本方法檢出限，氯霉素檢出限為0.1 μg·kg-1，以S/N=10 計算本方法的定量限為0.3 μg·kg-1。

2.5 精密度與回收率

向已知空白雞蛋樣品中添加濃度水平為0.3 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的氯霉素，進(jìn)行回收率測定，每個添加濃度測定6 次，內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果見表4。其回收率范圍為86%～118%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.0%，表示該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表4 氯霉素加標(biāo)回收率與精密度表

3 結(jié)論

本研究通過對液相色譜流動相、提取溶劑、凈化方式的優(yōu)化，建立了超高壓液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定雞蛋中氯霉素殘留的分析方法，該方法可有效減少基質(zhì)干擾，降低溶劑的基質(zhì)效應(yīng)，增加氯霉素的提取率，提高氯霉素的回收率，保證方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。該方法操作簡便高效、精密度好，適用于大批量樣品雞蛋中氯霉素殘留量的檢測。