食品中菌落總數(shù)檢測能力驗證分析

◎ 王文潔，李 瑩

（譜尼測試集團股份有限公司，湖北 武漢 430000）

食品安全關系民生，直接影響人們的身心健康和生活質(zhì)量，更是一個國家國民幸福指數(shù)和文明程度的體現(xiàn)[1]。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，生活條件的不斷提升，人們對食品安全的要求也不斷提高。我國的食品安全問題包括微生物污染、重金屬污染、農(nóng)藥獸藥殘留以及添加劑的非法使用等，其中，微生物污染是影響我國食品安全的一個主要因素，因此微生物檢驗是保證食品安全的重要前提[2]。菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理后，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每克（毫升）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)[3]。它是食品微生物檢測中的重要衛(wèi)生學指標，可直接反映出食品在生產(chǎn)、加工、運輸和儲藏等環(huán)節(jié)被微生物污染的情況，在一定程度上標志著食品生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生質(zhì)量控制狀況[4-5]。在歷年國家監(jiān)督抽檢工作中，調(diào)味品、乳制品、肉制品、方便食品、飲料和糕點等多個食品類別均涉及菌落總數(shù)項目。菌落總數(shù)的增加會加速食品腐敗變質(zhì)進程，使食品失去食用價值。當消費者食用了菌落總數(shù)超標的食品時，會出現(xiàn)各種腸道疾病，甚至嘔吐、發(fā)燒、腹瀉等，身體健康受到嚴重損傷[6]。因此，微生物實驗員應熟練掌握食品中菌落總數(shù)的檢測方法及操作要求，為市場監(jiān)督管理評價提供準確有效的數(shù)據(jù)支撐，從而保障消費者的權(quán)益[7]。

能力驗證是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則確定實驗室或檢測機構(gòu)檢測能力的一種活動，也是控制實驗室檢測質(zhì)量的重要方式[8-9]。能力驗證可幫助實驗室了解自身的檢測能力，證實檢測數(shù)據(jù)的準確性，及時發(fā)現(xiàn)并糾正自身的不足之處，總結(jié)經(jīng)驗指導日常的檢測工作[10-11]。為驗證實驗室是否具備檢測菌落總數(shù)的技術能力，確保檢測結(jié)果的可靠性，實驗室參加了由中國檢科院測試評價中心組織的ACASPT1081 食品中菌落總數(shù)檢驗能力驗證項目，采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)檢驗》（GB 4789.2—2016）的方法對2 份樣品進行檢驗，分析總結(jié)能力驗證試驗過程及結(jié)果，以期為菌落總數(shù)相關檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗室收到2 份中國檢科院測試評價中心組織的ACAS-PT1081 食品中菌落總數(shù)檢驗能力驗證發(fā)放的待測樣品，樣品編號分別為21-A560 和21-D485。2 份樣品均為西林瓶真空包裝的白色凍干塊狀人工污染食品。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

平板計數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA）和1% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC）溶液均采購自北京路橋技術股份有限公司，氯化鈉（Sodium Chloride，SC）購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BSC-400，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；蒸汽滅菌器（SX-700，日本TOMY）；生物安全柜（BSC-1604 ⅡA2，蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

在生物安全柜內(nèi)開啟西林瓶，立即加入5 mL 0.85%無菌生理鹽水進行再水化，待樣品充分溶解后，吸出至無菌瓶中，再用余下的55 mL 0.85%無菌生理鹽水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液于上述無菌瓶中，混勻，此溶液即為待測樣品原液。

1.4.2 樣品稀釋

充分混勻待測樣品原液，吸取1 mL 原液于9 mL 0.85%無菌生理鹽水中，制成1 ∶10 的樣品勻液。使用渦旋混合器充分混勻1 ∶10 的樣品勻液，吸取1 mL 1 ∶10 的樣品勻液于9 mL 0.85%無菌生理鹽水中，制成1 ∶100 的樣品勻液。依次類推，逐級進行10 倍系列稀釋，獲得10-5～100的樣品稀釋液。在進行10 倍遞增稀釋時，同時吸取1 mL 樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2 個平皿。試驗過程中設置兩種對照，分別為培養(yǎng)基空白對照和稀釋液空白對照，每個對照做2 個平皿。

1.4.3 培養(yǎng)計數(shù)

待PCA 培養(yǎng)基冷卻至46 ℃左右，向其中加入1% TTC 溶液，使TTC 終濃度為0.001%[12]。分別將15 ～20 mL 不 含TTC 的PCA 和 含0.001% TTC 的PCA 培養(yǎng)基傾注平皿中，轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)檢驗》（GB 4789.2—2016）的方法對菌落進行計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測試結(jié)果分析

由表1 可知，菌落計數(shù)結(jié)果與稀釋度倍數(shù)成反比，且同一稀釋度平行樣品間差異較小，表明實驗結(jié)果相對準確?？瞻讓φ諢o菌落生長，表明實驗過程無污染，實驗結(jié)果有效。

表1 樣品測試結(jié)果表

重復性試驗是使用相同方法，在同一實驗室檢測同一種物質(zhì)，由同一操作者使用同一設備在短時間內(nèi)的兩次獨立的單次實驗試驗結(jié)果的絕對差值，不應大于重復性限，r=0.25，以10 為底的每毫升中微生物計數(shù)的對數(shù)[13-14]。樣品21-A560 和21-D485 在10-1稀釋度的平板符合30 ～300 CFU 計數(shù)要求，在100稀釋度的平板上的菌落總數(shù)超過300 CFU，計為“多不可計”。在不加TTC 的情況下，由人員B 可知，21-A560 的第1 次和第2 次試驗結(jié)果分別為9.0×102CFU·mL-1和9.1×102CFU·mL-1，21-D485 的2 次試驗結(jié)果均為1.6×103CFU·mL-1，2 個樣品的2 次試驗結(jié)果的對數(shù)值絕對差值均為0.005，小于0.25，檢測結(jié)果滿足重復性要求。

復現(xiàn)性是指用同一方法檢測同一樣品，在不同實驗室由不同操作者使用不同設備得到的兩個單次實驗結(jié)果之間的絕對差值，不大于復現(xiàn)性限，R=0.45，以10 為底的每毫升中微生物計數(shù)的對數(shù)[13-14]。當TTC 終濃度為0%時，由第1 次試驗可知，對于21-A560，人員A 和人員B 的試驗結(jié)果分別為1.1×103CFU·mL-1和9.0×102CFU·mL-1，兩人試驗結(jié)果的對數(shù)值的絕對差值為0.085；對于21-D485，人員A 和人員B 的試驗結(jié)果分別為1.7×103CFU·mL-1和1.6×103CFU·mL-1，兩人試驗結(jié)果的對數(shù)值的絕對差值為0.025，均小于0.45，檢測結(jié)果滿足復現(xiàn)性要求。

在日常檢測中，一些固體樣品如餅干、糕點等殘渣在無菌生理鹽水中不能完全溶解，在培養(yǎng)基上會被誤讀為菌落，導致計數(shù)結(jié)果錯誤，研究發(fā)現(xiàn)TTC 的應用可解決這一難題[15]。TTC 溶于水是無色的，嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶可使無色的TTC 還原成紅色的三苯基甲臜（TPF），使菌落顯紅色，從而區(qū)分樣品顆粒和菌落[16-17]。由表1 可知，TTC 的添加濃度為0%和0.001%時，人員A 對樣品21-A560 的檢測結(jié)果分別為1.1×103CFU·mL-1和8.4×102CFU·mL-1，對數(shù)值分別為3.039 和2.924，差值為0.115。對樣品21-D485 的檢測結(jié)果分別為1.7×103CFU·mL-1和1.5×103CFU·mL-1，對 數(shù) 值 分別為3.230 和3.179，差值為0.051。對于同一樣品，含有0%和0.001% TTC 的菌落總數(shù)對數(shù)值的差值均小于0.25。由此可知，TTC 終濃度為0.001% 時，對菌落總數(shù)檢測無影響，這與葉超等[18]的研究發(fā)現(xiàn)一致。

2.2 能力驗證結(jié)果分析

能力驗證評價結(jié)果如表2 所示，能力評價準則為|Z|≤2.0 時，結(jié)果為滿意；當2.0 ＜|Z|＜3.0 時，結(jié)果可疑；|Z|≥3.0 時，結(jié)果不滿意。樣品21-A560 的|Z|值為-0.8，21-D485 的|Z|值為-1.6，兩者均＜2.0，能力評價結(jié)果為滿意。其中，21-D485 的|Z|值偏低，可能是由兩方面的原因造成的。①培養(yǎng)時間過長，本次試驗的培養(yǎng)時間為48 h，計數(shù)時發(fā)現(xiàn)有部分菌落被覆蓋，導致計數(shù)結(jié)果偏小。②未對培養(yǎng)基進行覆層，計數(shù)時發(fā)現(xiàn)菌落存在彌漫生長的現(xiàn)象，影響計數(shù)結(jié)果準確性。

表2 能力驗證評價結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

本次能力驗證中，2 個樣品的|Z|值均小于2.0，結(jié)果為滿意。通過此次能力驗證試驗，分析了以下幾個關鍵控制點，以便指導日常檢測工作。①收到能力驗證樣品后，首先檢查樣品是否存在破損、污染、密封性不強等問題，如發(fā)現(xiàn)問題及時與機構(gòu)聯(lián)系。若不能及時進行試驗，需按照作業(yè)指導書中的要求儲存樣品。②菌落總數(shù)測定為定量試驗，儀器設備會直接影響實驗結(jié)果。因此，試驗所用設備應定期進行檢定、校準和維護，減小設備誤差。③日常需做好試劑耗材的驗收工作，在整個試驗過程中，需保證所用培養(yǎng)基、試劑、耗材的無菌狀態(tài)。④微生物繁殖速度非?？?，一般20 ～30 min 即可繁殖一代，因此試驗過程需將操作時間控制在15 min 左右。⑤兩個樣品應獨立進行試驗，防止樣品交叉污染，保證結(jié)果的準確性。⑥在進行梯度稀釋時，每遞增稀釋一次，需換用1 次1 mL無菌槍頭。槍頭外面沾有高稀釋度的樣液，因此槍頭不能碰到下一稀釋度的液面和試管壁，避免下一稀釋度的菌落數(shù)量偏高。此外，試驗應多做幾個稀釋度，確保有適宜計數(shù)的平板。⑦TTC 可使菌落顯紅色，便于區(qū)分菌落和雜質(zhì)，同時可抑制某些革蘭氏陽性菌生長，防止菌落蔓延[12]。在檢測工作中，可在培養(yǎng)基中加入適宜濃度的TTC，但TTC 對溫度比較敏感，加入TTC 時需注意培養(yǎng)基的溫度。⑧傾注平皿時，培養(yǎng)基溫度需適宜。若溫度過高，培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)到皿蓋上，經(jīng)冷凝會滴落在培養(yǎng)基上，不利于單菌落的形成。同時，溫度高會滅活樣品中的菌落，造成計數(shù)結(jié)果偏低。若溫度過低，培養(yǎng)基會凝固成塊造成樣品分散不均勻，影響結(jié)果準確性。⑨如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基，避免菌落蔓延。⑩在培養(yǎng)期間，可提前24 h 觀察平板現(xiàn)象并進行第一次菌落計數(shù)，避免因培養(yǎng)時間過長造成菌落被覆蓋，或生長過快連到一起的情況。?試驗過程可分別設置培養(yǎng)基空白對照和生理鹽水空白對照。當生理鹽水空白對照無菌生長時，則證明生理鹽水和培養(yǎng)基均無問題。當生理鹽水空白對照有菌生長，但培養(yǎng)基空白對照無菌生長時，推斷生理鹽水存在問題。 ? 試驗過程中應在生物安全柜中放置敞開的營養(yǎng)瓊脂和孟加拉紅瓊脂平板，監(jiān)測試驗過程是否有細菌或霉菌的污染。?整個試驗過程需在生物安全柜中進行，防止樣液外溢，避免操作人員被感染。操作結(jié)束后，對生物安全柜進行滅菌，且將培養(yǎng)物進行無害化處理，避免污染環(huán)境。

本次能力驗證證實了實驗室對菌落總數(shù)的檢測能力，提升了檢驗人員的技術水平，增強了客戶對實驗室的信任度，為擴大實驗室核心競爭力奠定了基礎。但本次實驗也存在一些不足之處，實驗室僅采用了平板法對菌落總數(shù)進行檢測，在日后的工作中可考慮將菌落測試片法作為檢測輔助手段，兩種方法相互驗證，以保證數(shù)據(jù)的準確性，提高實驗室檢驗質(zhì)量。