基于抗肝纖維化生物活性及近紅外譜效相關(guān)的鱉甲質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

曹夢(mèng)珍，黃 倩，牛 明，趙 旭*，肖小河*

? 藥理與臨床 ?

基于抗肝纖維化生物活性及近紅外譜效相關(guān)的鱉甲質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

曹夢(mèng)珍1, 2，黃 倩2，牛 明2，趙 旭2*，肖小河1, 2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610032 2. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心 肝病醫(yī)學(xué)部研究所，北京 100039

從鱉甲臨床抗肝纖維化功效出發(fā)并結(jié)合近紅外光譜，探索建立關(guān)聯(lián)抗肝纖維化活性的鱉甲質(zhì)量生物活性評(píng)價(jià)方法。建立轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的LX-2肝纖維化細(xì)胞模型，采用qRT-PCR檢測(cè)鱉甲對(duì)I型膠原（type I collagen，）mRNA表達(dá)的影響，計(jì)算鱉甲對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量的抑制率；采用Western blotting檢測(cè)鱉甲對(duì)COL1蛋白表達(dá)的影響，以評(píng)價(jià)鱉甲在細(xì)胞模型上的抗肝纖維化生物活性。采集并處理不同批次鱉甲藥材的近紅外光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)譜-效相關(guān)分析探究鱉甲藥材近紅外光譜數(shù)據(jù)與其抗肝纖維化活性的相關(guān)性，篩選活性波段，建立鱉甲的效應(yīng)近紅外譜，以效應(yīng)近紅外譜下面積評(píng)價(jià)鱉甲藥材的質(zhì)量。體外實(shí)驗(yàn)表明，與模型組比較，鱉甲水提物（water extract of，WECT）處理組細(xì)胞中mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）；基于譜-效相關(guān)分析，共篩選得到＞0.6、＜0.05且波數(shù)大于8 cm?1的活性波段3個(gè)，分別為5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1，以3個(gè)活性波段下面積為指標(biāo)，建立鱉甲藥材的效應(yīng)近紅外譜，計(jì)算各特征波段下面積和，并分析其與生物活性的相關(guān)性，兩者相關(guān)系數(shù)為0.813 53。WECT可抑制LX-2細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)治療肝纖維化；效應(yīng)波譜下面積和（5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1）作為鱉甲藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)，用于評(píng)價(jià)鱉甲藥材的質(zhì)量，可區(qū)分不同批次鱉甲藥材的抗肝纖維化活性。

鱉甲；肝纖維化；質(zhì)量評(píng)價(jià)；生物評(píng)價(jià)；近紅外光譜；譜效相關(guān)分析

鱉甲來(lái)源于鱉科動(dòng)物鱉Wiegmann的背甲，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國(guó)已有上千年的使用歷史，中醫(yī)認(rèn)為其具有滋陰潛陽(yáng)、退熱除蒸、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，臨床用于治療陰虛發(fā)熱、勞熱骨蒸、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)、經(jīng)閉、癥瘕等癥[1-2]。既往系統(tǒng)生物學(xué)研究顯示，鱉甲提取物具有抗纖維化、抗氧化及抗腫瘤等藥理作用[2]。臨床研究也證實(shí)，以鱉甲為君藥組方的鱉甲軟肝片、鱉甲化纖方及鱉甲煎丸等復(fù)方中藥具有顯著減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的臨床療效[3-7]，可見(jiàn)鱉甲在肝纖維化治療領(lǐng)域具有廣闊前景。但目前，鱉甲的成分物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是其發(fā)揮抗肝纖維化作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究幾乎為空白[3]，同時(shí)，由于鱉甲為動(dòng)物藥，傳統(tǒng)的基于成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確客觀地判斷，這進(jìn)一步造成了其質(zhì)量難以保證等問(wèn)題。由于中藥質(zhì)量的一致性是保障其臨床療效穩(wěn)定性的重要因素，因此，有必要開(kāi)發(fā)質(zhì)量控制手段保障其在臨床抗肝纖維化治療領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

近紅外光譜技術(shù)作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品等多個(gè)行業(yè)領(lǐng)域。本課題組前期構(gòu)建了中藥效應(yīng)近紅外譜、整合近紅外光譜法以及生物評(píng)價(jià)2種評(píng)價(jià)方法，并以大黃配方顆粒為例表明與大黃配方顆粒瀉下活性高度相關(guān)的5個(gè)活性特征波段（4011～4390 cm?1、4859～5461 cm?1、7012～7493 cm?1、10 992～11 312 cm?1以及11 871～12 489 cm?1）能夠有效地將不同廠家不同批次的配方顆粒區(qū)分開(kāi)，可實(shí)現(xiàn)大黃配方顆粒質(zhì)量波動(dòng)的快速、在線檢測(cè)[8]。另有研究顯示，采用近紅外光譜技術(shù)可快速準(zhǔn)確地識(shí)別豬皮膠、牛皮膠、驢皮膠3種阿膠產(chǎn)品[9]；采用近紅外光譜分析技術(shù)建立的干姜中多指標(biāo)成分含量快速預(yù)測(cè)方法，可對(duì)不同產(chǎn)地干姜進(jìn)行快速無(wú)損的質(zhì)量評(píng)價(jià)[10]。以上研究表明近紅外光譜分析技術(shù)可將不同藥材或同一藥材的不同批次較好地區(qū)分，對(duì)于中藥材的質(zhì)量控制具有可觀的應(yīng)用前景。

鱉甲在肝纖維化臨床治療中應(yīng)用廣泛，肝纖維化作為慢性肝臟疾病的結(jié)局，其中心環(huán)節(jié)是肝細(xì)胞損傷引起的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活[11]，正常情況下HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，產(chǎn)生少量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）[12]，而激活的HSCs會(huì)產(chǎn)生大量的ECM，從而快速引起膠原化反應(yīng)[13]。ECM主要由I型膠原（type I collagen，COL1）、IV型膠原等組成，COL1側(cè)向排列形成的大量膠原纖維是肝纖維化的典型特征，也是肝纖維化嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）為肝纖維化模型的活化劑，可使HSC處于高活化狀[5]。因此，對(duì)于動(dòng)物藥鱉甲的質(zhì)量控制，采用與臨床療效直接關(guān)聯(lián)的抗肝纖維化生物評(píng)價(jià)模式，基于譜-效相關(guān)建立活性校正的指紋圖譜，對(duì)于保障鱉甲的質(zhì)量，擁有良好的應(yīng)用遠(yuǎn)景。

本研究以鱉甲為模式藥，以“源自臨床，證于實(shí)驗(yàn)”為研究路徑，從鱉甲的臨床作用出發(fā)，基于TGF-β1誘導(dǎo)的人HSC細(xì)胞系LX-2肝纖維化細(xì)胞模型，初步探索鱉甲水提物的抗肝纖維化生物活性，為鱉甲的質(zhì)量控制及鱉甲抗肝纖維化機(jī)制研究提供線索；對(duì)鱉甲近紅外譜信息與抗肝纖維化生物活性進(jìn)行相關(guān)性分析，建立關(guān)聯(lián)活性的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，以期克服鱉甲質(zhì)量控制與生物活性關(guān)聯(lián)不強(qiáng)、代表性不足等問(wèn)題。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人肝星狀LX-2細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)中心提供。

1.2 藥材

鱉甲藥材（具體信息見(jiàn)表1）購(gòu)自北京安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肖小河研究員鑒定為鱉科動(dòng)物鱉Wiegmann的背甲，且按《中國(guó)藥典》2020年版要求檢查合格。

表1 18批次鱉甲藥材樣品信息

1.3 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)CM10013）購(gòu)自北京中科邁晨生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗（批號(hào)CC008）、胰酶（批號(hào)CC008）購(gòu)自邁晨科技（北京）有限公司；CCK-8試劑（批號(hào)FC0720）、RT Master Mix for qPCR（批號(hào)HY-K0510）、SYBR Green qPCR Master Mix（批號(hào)HY-K0521）購(gòu)自Med Chem Express公司；qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成；RNA快速純化試劑盒（批號(hào)ES-RN001）購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司；RIPA裂解液（批號(hào)C1053）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒（批號(hào)C190501）購(gòu)自北京陽(yáng)光英銳生物科技有限公司；COL1多克隆抗體（批號(hào)72026S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH多克隆抗體（批號(hào)A01020）購(gòu)自Abbkine公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)P21118）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號(hào)P21206）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 儀器

HF100型CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2F/2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化儀器廠）；IX70型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；MSA36S型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲波儀器有限公司）；MPA型傅立葉變換近紅外分析儀（德國(guó)Bruker公司）；Fresco 21型超低速低溫離心機(jī)、ABI QuantStudio 6 Flex型熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；5200Multi型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 提取物的制備 稱取鱉甲藥材，粉粹，過(guò)80目篩，料液比1∶20，40 ℃、250 kW超聲水提30 min，減壓濃縮，冷凍干燥，得鱉甲藥材的超聲水提物（water extract of，WECT），備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取上述提取物粉末，按照要求配制成相應(yīng)濃度，過(guò)0.22 μm濾膜，得供試品溶液。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 WECT細(xì)胞毒性的測(cè)定 將LX-2細(xì)胞以2×105個(gè)/mL均勻接種于96孔板中，100 μL/孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入生藥質(zhì)量濃度為0、25、50、100、150、200、300 mg/mL的WECT處理1 h，隨后加入20 ng/mL TGF-β1共培養(yǎng)24 h，按照CCK-8試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.2.2 qRT-PCR驗(yàn)證WECT抗肝纖維化生物活性 將LX-2細(xì)胞以2×105個(gè)/mL均勻接種于24孔板中，500 μL/孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入生藥質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200、300 mg/mL的WECT處理1 h，隨后加入20 ng/mL TGF-β1共培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

計(jì)算WECT對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量的抑制率，并計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度（50% effective concentration，EC50）值。隨后在EC50對(duì)應(yīng)的生藥濃度下，考察不同批次WECT對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)的抑制率，評(píng)價(jià)鱉甲藥材的抗肝纖維化生物活性。

相對(duì)表達(dá)量抑制率＝(模型組相對(duì)表達(dá)量－給藥組相對(duì)表達(dá)量)/模型組相對(duì)表達(dá)量

2.2.3 Western blotting檢測(cè)WECT抗肝纖維化生物活性 將LX-2細(xì)胞以2×105個(gè)/mL均勻接種于6孔板中，2 mL/孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入生藥質(zhì)量濃度為120、160、200、300 mg/mL的WECT處理1 h，隨后加入20 ng/mL TGF-β1共培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入COL1、GAPDH抗抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入二抗，室溫孵育1 h，最后用ECL發(fā)光液顯影。

2.3 近紅外光譜數(shù)據(jù)采集及處理

選取10批（S1～S10）鱉甲藥材，用于建立基于效應(yīng)近紅外譜的鱉甲質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其余8批（S11～S18）用于驗(yàn)證質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性。取適量WECT，加入去離子水溶解至生藥質(zhì)量濃度1000 mg/mL，統(tǒng)一裝入1 mL液體樣品測(cè)量管，采集光譜。采樣方式：光譜掃描范圍12 500～4000 cm?1，分辨率8 cm?1，以去離子水溶液為空白，掃描32次，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均光譜。為了排除干擾因素造成測(cè)量結(jié)果的偏倚，利用OPUS7.5軟件對(duì)近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理，并對(duì)經(jīng)過(guò)一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的近紅光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分析。

2.4 不同批次的鱉甲藥材抗肝纖維化生物活性的評(píng)價(jià)

在40、60、120、160、200、300 mg/mL生藥質(zhì)量濃度下測(cè)定WECT對(duì)肝纖維化模型細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量的抑制率，并計(jì)算EC50值。檢測(cè)生藥濃度為EC50時(shí)，10個(gè)批次WECT對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化模型細(xì)胞中mRNA表達(dá)量的抑制率，評(píng)價(jià)不同批次鱉甲藥材的抗肝纖維化生物活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8法檢測(cè)WECT的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示W(wǎng)ECT在生藥濃度不超過(guò)300 mg/mL下處理LX-2細(xì)胞24 h無(wú)細(xì)胞毒性（圖1-A）。肝星狀細(xì)胞的活化與增殖是肝纖維化的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2肝纖維化細(xì)胞模型，用于評(píng)價(jià)WECT的抗肝纖維化生物活性。如圖1-B、C所示，與對(duì)照組比較，模型組mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，WECT（120、160、200、300 mg/mL）組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），300 mg/mL WECT可顯著抑制COL1蛋白的表達(dá)（＜0.05）。

A-WECT對(duì)LX-2細(xì)胞存活率的影響 B-WECT對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞COL1 mRNA表達(dá)的影響 C-WECT對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞COL1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.2 近紅外光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理與相似度分析

10批鱉甲藥材（S1～S10）的近紅外光譜數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2-A，OPUS7.5軟件對(duì)近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理見(jiàn)圖2-B。對(duì)經(jīng)過(guò)一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理的近紅光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分析（表3），結(jié)果顯示10批鱉甲藥材的相似大于0.9，這表明10批鱉甲藥材的近紅外光譜信息的相似度高，提示單以近紅外光譜數(shù)據(jù)難以實(shí)現(xiàn)鱉甲藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.3 不同批次的鱉甲藥材抗肝纖維化生物活性的評(píng)價(jià)

在40、60、120、160、200、300 mg/mL生藥質(zhì)量濃度下測(cè)定WECT對(duì)肝纖維化模型細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量的抑制率，計(jì)算得到EC50值為149.5 mg/mL，結(jié)果見(jiàn)圖3-A。據(jù)此，檢測(cè)在生藥質(zhì)量濃度為150 mg/mL時(shí)10個(gè)批次WECT對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化模型細(xì)胞中mRNA表達(dá)量的抑制率，評(píng)價(jià)不同批次鱉甲藥材的抗肝纖維化生物活性，結(jié)果見(jiàn)圖3-B。

A-10批鱉甲藥材的近紅外光譜數(shù)據(jù) B-經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理后的10批鱉甲藥材的近紅外光譜信息

表3 10批鱉甲藥材（S1～S10）的相似度分析

A-WECT對(duì)肝纖維化模型細(xì)胞中COL1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的EC50 B-10批WECT對(duì)COL1 mRNA表達(dá)量的抑制率

3.4 鱉甲藥材效應(yīng)近紅外譜的建立與應(yīng)用

對(duì)10批鱉甲藥材的近紅外光譜數(shù)據(jù)和鱉甲對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化模型細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)量的抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，共篩選得到＞0.6、＜0.05，且波數(shù)大于8 cm?1的活性波段3個(gè)，分別為5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1（圖4-A、B）。為進(jìn)一步探究各活性波段與鱉甲藥材抗肝纖維化生物活性的相關(guān)性，以各活性波段下面積為指標(biāo)構(gòu)建鱉甲藥材的效應(yīng)近紅外譜（圖4-C），結(jié)果表明不同鱉甲藥材的效應(yīng)近紅外譜之間存在一定的差異性。將各效應(yīng)波譜下面積和作為鱉甲藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)，用于評(píng)價(jià)鱉甲藥材的質(zhì)量，結(jié)果表明鱉甲藥材的抗肝纖維化活性與質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)呈顯著正相關(guān)（＝0.886 23，圖4-D）。

3.5 鱉甲藥材效應(yīng)近紅外譜的驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性，本研究另取8批鱉甲藥材（S11～S18），采集其近紅外光譜信息并進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理，結(jié)果見(jiàn)圖5-A。測(cè)定其抗纖維化活性，結(jié)果見(jiàn)圖5-B。計(jì)算各特征波段下的面積，建立效應(yīng)近紅外光譜，見(jiàn)圖5-C。隨后計(jì)算各批次藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)（質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)＝SW1＋SW2＋SW3，SW1、SW2、SW3分別表示5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?13個(gè)波段下的面積和），并將各批次藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)與與其抗肝纖維化活性進(jìn)行相關(guān)性分析（圖5-D），結(jié)果顯示兩者呈顯著正相關(guān)（＝0.813 53），這表明基于鱉甲效應(yīng)近紅外譜構(gòu)建的鱉甲質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)能夠較好評(píng)價(jià)鱉甲抗肝纖維化生物活性。

A-10批WECT近紅外光譜信息與其生物活性的相關(guān)性分析結(jié)果 B-活性波段篩選示意圖 C-10批鱉甲藥材的效應(yīng)近紅外譜 D-10批鱉甲藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)與生物活性相關(guān)性分析結(jié)果圖，其中質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)＝SW1＋SW2＋SW3，SW1、SW2、SW3分別表示5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1 3個(gè)波段下的面積和

A-8批驗(yàn)證藥材的近紅外光譜信息 B-8批驗(yàn)證藥材的抗肝纖維化生物活性 C-8批驗(yàn)證藥材活性波段下效應(yīng)近紅外譜 D-效應(yīng)近紅外譜與生物活性相關(guān)性分析

4 討論

鱉甲在臨床應(yīng)用廣泛，以鱉甲為君藥的復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)肝纖維化及早期肝硬化的療效顯著，是我國(guó)為數(shù)不多的用于治療肝纖維化的藥物[14]。近年來(lái)不少學(xué)者，基于生物評(píng)價(jià)建立了反映中藥功效與毒性、中藥制劑的一致性等的評(píng)價(jià)方法，但對(duì)于以鱉甲為例的藥效物質(zhì)尚不明確的動(dòng)物藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較少[15]。因此關(guān)聯(lián)生物活性的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法建立對(duì)于鱉甲的開(kāi)發(fā)與利用有著重要意義[16]。據(jù)此，本研究以鱉甲為模式藥物，結(jié)合鱉甲的抗肝纖維化生物活性與鱉甲藥材近紅外指紋圖譜，通過(guò)譜-效相關(guān)分析，探究鱉甲的活性波段，用于鱉甲的質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為動(dòng)物藥質(zhì)量控制模式的建立與健全提供參考。

首先，本研究在細(xì)胞水平證實(shí)了鱉甲水提物的抗肝纖維化生物活性，實(shí)驗(yàn)表明，WECT可以減少TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化LX-2細(xì)胞模型中mRNA及蛋白的表達(dá)，這提示W(wǎng)ECT可能通過(guò)抑制ECM的沉積而發(fā)揮抗肝纖維化生物活性；在此基礎(chǔ)上，本研究基于WECT對(duì)肝纖維化細(xì)胞模型中mRNA表達(dá)量的抑制率，建立了鱉甲藥材生物活性評(píng)價(jià)方法；并通過(guò)對(duì)生物活性與近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出具有高相關(guān)性的3個(gè)活性波段，分別為5226～5235 cm?1、5943～6071 cm?1與6379～6396 cm?1，以此3個(gè)活性波段下面積為指標(biāo)建立了鱉甲抗肝纖維化效應(yīng)近紅外譜，以效應(yīng)近紅外譜下面積和，作為質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)，并應(yīng)用于鱉甲藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)與抗肝纖維化生物活性呈正相關(guān)且相關(guān)性良好，這提示基于效應(yīng)近紅外譜建立鱉甲的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)，在一定程度上能夠區(qū)別不同鱉甲的抗肝纖維化生物活性。

綜上，本研究以鱉甲為例，首先在細(xì)胞水平驗(yàn)證了鱉甲的抗肝纖維化生物活性，通過(guò)近紅外光譜數(shù)據(jù)的分析與抗肝纖維化活性評(píng)價(jià)，建立了鱉甲效應(yīng)近紅外譜，并通過(guò)計(jì)算鱉甲的質(zhì)量評(píng)價(jià)系數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鱉甲功效質(zhì)量的評(píng)價(jià)，為鱉甲藥材的開(kāi)發(fā)與利用提供了有力保障，從而為鱉甲及動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立或建全提供了新的線索。此外，基于效應(yīng)近紅外譜活性波段的鱉甲質(zhì)量評(píng)價(jià)，是關(guān)聯(lián)生物活性、操作相對(duì)簡(jiǎn)便的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，可為其他動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立或完善提供一定參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation ofbased on anti-liver fibrosis biological activity and effect-related near-infrared spectrum

CAO Meng-zhen1, 2, HUANG Qian2, NIU Ming2, ZHAO Xu2, XIAO Xiao-he1, 2

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China 2. Department of Hepatology, the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China

To explore the biological activity evaluation method of Biejia () quality related to anti-hepatic fibrosis activity based on its clinical anti-hepatic fibrosis effect and combined with near-infrared spectroscopy.Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) induced LX-2 liver fibrosis cell model was established, qRT-PCR was used to detect the effect ofon type I collagen () mRNA expression, the inhibition rate ofmRNA expression was calculated; Western blotting was used to detect the effect ofon COL1 protein expression to evaluate the anti-hepatic fibrosis bioactivity ofon cell model. Near-infrared spectral data of different batches ofwere collected and processed, the correlation between near-infrared spectral data ofand their anti-liver fibrosis activity through spectrum effect correlation analysis was explored, and the active band was screened. The effect-near infrared spectrum ofwas established, and the area under the effect near infrared spectrum was used to evaluate the quality of.experiments showed that compared with model group,mRNA and protein expressions in water extract of(WECT) were significantly decreased (< 0.05, 0.01). Based on spectrum effect correlation analysis, three active bands with> 0.6,< 0.05 and wave number greater than 8 cm?1were screened, which were 5226—5235 cm?1, 5943—6071 cm?1and 6379—6396 cm?1, respectively. Taking the area under the three active wavebands as the index, the effective near-infrared spectrum ofwas established, the area sum under each characteristic waveband was calculated, and its correlation with biological activity was analyzed. The correlation coefficient between the two was= 0.813 53.WECT can inhibit the production of LX-2 extracellular matrix to treat liver fibrosis; The sum of the area under the effect spectrum (5226—5235 cm?1, 5943—6071 cm?1and 6379—6396 cm?1) is used as the quality evaluation coefficient ofto evaluate the quality of, which can distinguish the anti-liver fibrosis activity of different batches ofmedicine.

; liver fibrosis; quality evaluation; biological evaluation; near-infrared spectroscopy; spectrum-effect correlation analysis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3150 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.012

2023-01-16

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81930110）；國(guó)家中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ZYYCXTD-C-202005）

曹夢(mèng)珍（1997—），女，碩士研究生。E-mail: Caomengzhen1213@163.com

肖小河，主要從事中藥鑒定學(xué)和臨床中藥學(xué)工作。Tel: (010)66933322 E-mail: pharmacy302xxh@126.com

趙 旭，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: xuzhao080@outlook.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]