紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇及其類似物內(nèi)生菌的分離與篩選

鄭寒琪 沈詩媚 趙玉知 陳營

摘要 為了從紅豆杉中分離篩選可以產(chǎn)紫杉醇及其類似物的內(nèi)生菌，本研究以紅豆杉為試驗材料，對其針葉和枝條通過劃線分離法共篩選得到9株內(nèi)生菌，對所得菌株用不同發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液及菌體經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮后以紫杉醇標準品為對照進行薄層層析（TLC）檢測。試驗發(fā)現(xiàn)9株內(nèi)生菌中有4株可以產(chǎn)生紫杉醇及其類似物，其中內(nèi)生真菌有3株，內(nèi)生細菌有1株。通過細菌16S rDNA擴增測序和真菌Its擴增測序分析可知，3株內(nèi)生真菌初步確定為1株鏈格孢菌（Alternaria sp.）和2株P(guān)araconiothyrium brasiliense，1株細菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；相同菌株用不同發(fā)酵培養(yǎng)基時，樣品Rf值不同，表明培養(yǎng)基成分會影響菌體進入次級代謝的時間，并進一步影響前體物質(zhì)向紫杉醇的轉(zhuǎn)化。試驗結(jié)果為后續(xù)紫杉醇這一天然中藥成分的生物合成及其代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 紅豆杉；內(nèi)生菌；紫杉醇；生物合成；代謝調(diào)控

中圖分類號 Q949.9? ?文獻標識號 A

文章編號 1007-7731（2023）05-0027-05

紫杉醇（Paclitaxel，商品名 Taxol）是一種復(fù)雜的含氮二萜類衍生物，于1971年被美國科學家Wani等[1]從短葉紅豆杉（Taxus breviifolia）的樹皮中分離出來。紫杉醇能抑制微管蛋白解聚，有效抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且抑制腫瘤生長的機理已被闡明，在臨床上被廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分頭頸癌和肺癌的治療[2-3]。紫杉醇作為具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，其新穎復(fù)雜的化學結(jié)構(gòu)、廣泛顯著的生物活性、全新獨特的作用機制、奇缺的自然中藥資源使其成為舉世矚目的抗癌明星和研究重點。

天然紅豆杉樹生長極其緩慢且不易繁殖，使得紅豆杉的自然資源比較奇缺，且其作為中藥成分的紫杉醇提取率很低，30 t干樹皮才可以得到大約100 g紫杉醇，難以大規(guī)模實現(xiàn)藥用價值，利用紅豆杉內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇具有生產(chǎn)周期短、紫杉醇產(chǎn)率高等優(yōu)點。國內(nèi)外許多學者對紅豆杉產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生菌進行了大量的研究，研究目前主要集中在兩個方面：一是分離出更多的產(chǎn)紫杉醇的高產(chǎn)菌株；二是對已有產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌進行改良，使其適合產(chǎn)業(yè)化需求。1993年Stierle等[4]首次從短葉紅豆杉中分離到產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌并將其命名為Taxomyces andreanae；方榮鋒等[5]分離到產(chǎn)紫杉醇的曲霉屬煙曲霉（Aspergillus fumigatus）并將其命名為煙曲霉TMS-26；席曉圓等[6]在紅豆杉樹皮中分離到一株高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，并證明其為黑孢霉屬（Nigrospora sp.）。

由于不同的培養(yǎng)基會對產(chǎn)物含量產(chǎn)生巨大影響，所以為了避免產(chǎn)物含量過低導(dǎo)致檢測失誤，本試驗采用2種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，成功地從紅豆杉中分離到可產(chǎn)生紫杉醇類化合物的3株內(nèi)生真菌和1 株內(nèi)生細菌，以期為產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌的研究提供科學依據(jù)，從而解決紫杉醇這一天然中藥成分的供應(yīng)危機和開發(fā)利用問題。

1 材料與方法

1.1 材料準備

新鮮采摘的加拿大曼地亞紅豆杉針葉和枝條，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑準備

青霉素（福州飛凈生物科技有限公司）、鏈霉素（范德生物科技有限公司）、乙酸乙酯（國藥集團化學試劑）、異丙醇（天津市永大化學試劑有限公司）、乙酸鈉（國藥集團化學試劑）、苯甲酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）、L－苯丙氨酸（上海如吉生物科技有限公司）、香草醛（天津市森源化學試劑有限公司）和紫杉醇33069-62-4標準品（純度為98%，成都鈉鈳鋰生物科技有限公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基準備

①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮煮汁，過濾取液）200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，自然pH，121℃，20 min滅菌。②發(fā)酵培養(yǎng)基A：蔗糖20 g蛋白胨1.5 g，KH2PO4 5 g，MgSO4 2 g，Na2HPO4 0.2 g，CaCl2 0.03 g，F(xiàn)eSO4 0.05 g，CuSO4·5H2O 0.005 g，MnSO4 0.001 g，苯甲酸0.02 g，乙酸鈉0.2 g，苯丙氨酸0.02 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃，20 min滅菌。③發(fā)酵培養(yǎng)基B：馬鈴薯200 g，酵母膏2 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂0.1 g，苯丙氨酸0.02 g，乙酸鈉0.2 g，苯甲酸0.02 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃，20 min滅菌。

1.4 紅豆杉內(nèi)生菌的分離與純化

1.4.1 樣品處理。用無菌水清洗紅豆杉的枝條和針葉：將枝條用無菌水浸泡10 min，用消毒后的手術(shù)剪、手術(shù)刀將枝條去芯并截成0.5 cm左右的小段，將針葉用無菌水清洗后剪成1 cm長的小段，剪好的枝條和針葉先用75%酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗3～4次，在超凈臺內(nèi)風干后備用。

1.4.2 內(nèi)生真菌的接種培養(yǎng)。在超凈臺內(nèi)將處理好的紅豆杉枝條和針葉以切口斷面垂直接種于加有青霉素和鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)皿放置10塊枝條或針葉，依次編號，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。

1.4.3 內(nèi)生細菌的接種培養(yǎng)。將處理好的紅豆杉枝條和針葉分別浸泡于兩支裝有15 mL無菌水的滅菌試管中，在功率為10 KHz的超聲波清洗器中震15 min，在超凈臺內(nèi)各取兩支試管中液體1 mL，分別涂布于兩個不加青霉素和鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基表面。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。

1.4.4 內(nèi)生菌的分離純化與保存。待觀察到內(nèi)生菌菌落從切口處長出后，用接種環(huán)挑取單菌落接種至新的PDA固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)出單菌落后，轉(zhuǎn)化5～6次以純化菌株。純化后的菌株編號后，放入冰箱冷凍保存以留存菌種。

1.5 產(chǎn)紫杉醇及其類似物內(nèi)生菌的篩選

1.5.1 分離菌種的發(fā)酵培養(yǎng)。將活化的菌體在超凈臺內(nèi)用接種環(huán)接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶中（接種于發(fā)酵培養(yǎng)基A和B中），置于28 ℃，3 000 r·min-1的全溫振蕩器中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d。（因菌株不同培養(yǎng)時間略有差異，實際培養(yǎng)時間以搖瓶培養(yǎng)的菌絲球不再明顯增加為限）。

1.5.2 發(fā)酵液和菌體的產(chǎn)物提取。待搖床培養(yǎng)至培養(yǎng)基中含有大塊菌體、菌絲球不再明顯增加后，采用離心的方法將菌體與發(fā)酵液分離。將分離得到的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到三角瓶中加入1/2發(fā)酵液體積的乙酸乙酯靜置萃取一夜，將上層萃取液分離出來作為樣品。

將分離得到的菌體首先在烘干箱內(nèi)50 ℃條件下烘干，隨后用研缽進行研磨，使菌體破碎，內(nèi)溶物釋放，將研磨物轉(zhuǎn)移至5 mL的EP管中加入2 mL乙酸乙酯靜置萃取一夜，將上層萃取液分離出來作為樣品用于薄層分析。

1.5.3 紫杉醇及其類似物的薄層層析（TLC）。將硅膠HSGF254板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）放置105 ℃的烤箱中活化30 min，取出后冷卻。用點樣毛細管將分離得到的菌體萃取液和發(fā)酵液萃取液以及1 mg/L紫杉醇標準品于5 cm×10 cm規(guī)格的層析硅膠板中點樣，點樣量適中（菌體浸提液不少于20 μL，發(fā)酵液不少于40 μL），點樣點距前端約1.5～2.0 cm，間距1.0～2.0 cm，直徑約 1～2 mm。展層在100 mm×100 mm規(guī)格的P型密閉層析缸（上海壘固儀器有限公司）中進行，層析前預(yù)先在密閉層析缸中加入展開劑乙酸乙酯∶異丙醇（96∶6，V/V）進行預(yù)飽和30 min。

展開劑行至距硅膠板前沿1.5～2 cm時停止層析，將硅膠板拿出層析缸迅速風干，然后立即將顯色劑（甲醇/濃硫酸/香草醛（90∶10∶1，V/V/M））均勻噴至硅膠板表面，隨后放入100 ℃烤箱中加熱干燥顯色（或者用吹風機進行加熱），實時觀察紫杉醇標準品與樣品的斑點大小、位置、顏色。分別量取標準品和樣品原點至顯色斑點間的距離，并計算層析斑點的 Rf 值，通過對比分析，初步判斷紅豆杉內(nèi)生菌菌體及發(fā)酵液中是否含有紫杉醇類化合物。

1.6 內(nèi)生菌的鑒定

對篩選得到的菌種進行分子鑒定，細菌采用16S rDNA擴增測序方法，真菌采用ITS擴增測序方法。測序由睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)果拼接后在GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進行在線比對分析，確定菌種的歸屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離和純化

根據(jù)內(nèi)生菌的菌落特征，經(jīng)仔細鑒別，剔除可能重復(fù)的菌株，總共分離得到9株內(nèi)生菌，其中有7株真菌和2株細菌。除1株細菌來源于針葉，其余均從枝條中分離，分離結(jié)果見表1。

2.2 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌的篩選

將純化的菌株分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基A和發(fā)酵培養(yǎng)基B進行搖床培養(yǎng)2～3 d。以發(fā)酵液和菌體萃取處理后的樣品與紫衫醇標準品進行薄層比較，結(jié)果見表2。

通過薄層層析篩選，9株內(nèi)生菌中只有1-1、3-2、5-1、6-1菌株有明顯斑點出現(xiàn)，且使用發(fā)酵培養(yǎng)基A時樣品斑點與紫杉醇標準品斑點等位，而使用發(fā)酵培養(yǎng)基B的菌株斑點均處于標準品前端。

發(fā)酵培養(yǎng)基A中培養(yǎng)的3-2和6-1菌株的菌體及發(fā)酵液萃取液斑點Rf值在0.93～0.94之間，與紫杉醇標準樣品的Rf值0.938相近，紫杉醇標準品斑點呈現(xiàn)靛紫色橢圓狀，樣品斑點與標準品斑點等位，大小相近，顏色稍淺，因而認為3-2和6-1菌株的菌體及發(fā)酵液萃取液中可能含有紫杉醇或紫杉烷類似物。而使用發(fā)酵培養(yǎng)基A培養(yǎng)的3-3、6-2、6-3、8-1四株菌的菌體及發(fā)酵液均無斑點出現(xiàn)，結(jié)果見圖1。

發(fā)酵培養(yǎng)基B中培養(yǎng)的1-1和6-1菌株的發(fā)酵液萃取液以及5-1和6-1菌株的菌體萃取液斑點Rf值均略大于0.938，樣品斑點位于標準品斑點前端，大小相近，顏色稍淺，因而認為1-1和6-1菌株的發(fā)酵液萃取液以及5-1和6-1菌株的菌體萃取液中可能含有紫杉醇類似物或者紫杉醇前體物質(zhì)。4-1和8-1株菌無斑點出現(xiàn)，結(jié)果見圖2。

2.3 內(nèi)生菌株的鑒定

測序后，經(jīng)Blast在線對比分析得出1-1株為鏈格孢菌（Alternaria sp.）、3-2和6-1株為Paraconiothyrium brasiliense、5-1株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。除枯草芽孢桿菌為細菌外，其余3株菌皆為真菌。

3 實驗結(jié)果討論

目前產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌已報道有40多個屬，如擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis microspora、樹狀多節(jié)孢Noduzisporium sylviforme、鏈格孢菌Alternaria、莖點霉屬Phomopsis、曲霉屬Aspergillus niger var等[7-11]。但關(guān)于紅豆杉產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生細菌的相關(guān)報道還比較少。宋培勇等[12]曾使用劃線分離法分離得到紅豆杉內(nèi)生細菌的優(yōu)勢菌屬——芽孢桿菌。本試驗與之分離方法不同，是對紅豆杉枝條和針葉進行超聲波振動處理后成功分離到內(nèi)生枯草芽孢桿菌，并驗證了其產(chǎn)紫杉醇類似物的能力?？莶菅挎邨U菌一直以來被廣泛關(guān)注的是其在植物病害防治中的作用，尚未發(fā)現(xiàn)有其代謝產(chǎn)物與紫杉醇合成有關(guān)的相關(guān)研究；本試驗首次報道了從曼地亞紅豆杉中分離出產(chǎn)紫杉醇類似物的枯草芽孢桿菌，豐富了產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生細菌的種群資源；另一方面，細菌較真菌的生長及代謝周期短，使紫杉醇的產(chǎn)率可以進一步提高，是未來紫杉醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個重要方向。張智慧等[13]研究證明鏈格孢菌和Paraconiothyrium brasiliense為紅豆杉內(nèi)生真菌，且鏈格孢菌可以產(chǎn)生紫杉醇。本試驗的結(jié)果不僅驗證了鏈格孢菌產(chǎn)紫杉醇的能力，還證明了Paraconiothyrium brasiliense同樣具有產(chǎn)紫杉醇的能力。在試驗人員以及試驗方法有異的情況下卻同樣分離得到鏈格孢菌屬，由此可認為此菌易于分離，具有一定的開發(fā)利用價值，可以作為提高紫杉醇發(fā)酵生產(chǎn)含量的研究對象，為量產(chǎn)紫杉醇及其類似物奠定研究基礎(chǔ)。

大部分關(guān)于紫杉醇發(fā)酵生產(chǎn)的研究是為了提高紫杉醇的產(chǎn)量以便使用，由本試驗結(jié)果也可以清楚地看到所有樣品斑點顏色均淺于標準品，這可能是發(fā)酵培養(yǎng)條件的限制使產(chǎn)物濃度過低所致。所以，為避免由于含量過低而導(dǎo)致檢測失誤，本試驗使用了2種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基。有研究表明培養(yǎng)基中碳源和氮源的不同會影響紫杉醇及其類似物質(zhì)產(chǎn)生的含量，提高氮源濃度能夠?qū)t豆杉內(nèi)生菌的生長起到促進作用，濃度過高則抑制次級代謝產(chǎn)物的形成，適量的Mg2+可促進紫杉醇的合成，并促進前體物向紫杉醇轉(zhuǎn)化[14]。本試驗中發(fā)酵培養(yǎng)基B的氮源豐富于A，且Mg2+少于培養(yǎng)基A，可以使菌體較晚進入次生代謝，導(dǎo)致前體物質(zhì)尚未進一步轉(zhuǎn)化成紫杉醇，所以出現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基A中菌株樣品斑點與紫杉醇標準品斑點等位，而培養(yǎng)基B中樣品斑點均高于標準品的現(xiàn)象。董慧茹等[15]分離純化紫杉醇和三尖杉寧堿的TLC檢測色譜圖中顯示，三尖杉寧堿斑點的位置高于紫杉醇標準品，故此推測本試驗中所產(chǎn)生的紫杉醇前體物質(zhì)為三尖杉寧堿。

4 結(jié)論

紅豆杉是天然中藥成分紫杉醇的重要來源，具有極大的開發(fā)利用價值，本研究采用2種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，以均含有紫杉醇生物合成途徑中的部分前體物質(zhì)以確保試驗的順利進行。本試驗成功篩選到能夠產(chǎn)紫杉醇及其類似物如三尖杉寧堿的紅豆杉內(nèi)生菌，為天然中藥成分紫杉醇的開發(fā)利用以及量產(chǎn)使用奠定了一定的基礎(chǔ)。

后續(xù)研究的重點將探究紫杉醇的生物合成及其代謝調(diào)控，探究培養(yǎng)基中前體物質(zhì)和微量元素對菌體進入次級代謝產(chǎn)生紫杉醇及其類似物的影響，建立紫杉醇合成途徑中關(guān)鍵酶的高效表達，使其盡可能減少副產(chǎn)物的生成，從而大量產(chǎn)生紫杉醇及合成紫杉醇的前體物質(zhì)。

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（責編：張 蓓）

基金項目 煙臺市重點研發(fā)計劃。

陳營*通信作者

收稿日期 2022-05-12