龍腦樟萜類的轉(zhuǎn)錄和代謝差異分析

黃曉玲, 嚴(yán)寒靜, 劉春琰, 李思琪, 田鑫慧, 邵長(zhǎng)柳, 龐玉新,4

(1.廣東藥科大學(xué)中藥資源學(xué)院, 廣東 云浮 527300; 2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 廣州 510006;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 鄭州 450046; 4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025)

樟(Cinnamomumcamphora(L.) presl)為樟科樟屬植物,其加工產(chǎn)品可供醫(yī)藥、香料工業(yè)和建筑工業(yè)使用,分布于我國(guó)南方及西南各省區(qū)。樟在種植過(guò)程中發(fā)生雜化,分化成不同化學(xué)型,龍腦樟(Cinnamomumcamphorachvar. Borneol)為其中一種。單萜為龍腦樟精油的主要成分之一,而右旋龍腦(天然冰片)是單萜化合物中含量最高的成分,具有清熱止痛、開(kāi)竅醒腦、保護(hù)神經(jīng)和抗菌抗病毒作用[1]。隨著右旋龍腦應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和分子生物技術(shù)的快速發(fā)展,人們已獲悉右旋龍腦的生物合成途徑。植物需要先通過(guò)胞漿的甲羥戊酸途徑(Mevalonic acid,MVA)或質(zhì)體的甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)生成所有萜類的通用底物異戊二烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate, IPP)和異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate,DMAPP);在依賴金屬離子的單萜合酶(Monoterpene synthases,mono-TPS)催化下,由1分子IPP和1分子DMAPP生成的單萜類底物香葉基焦磷酸(Geranyl diphosphate,GPP)轉(zhuǎn)移二磷酸基團(tuán)生成中間體二磷酸芳樟酯(Linalyl diphosphate,(3 R)/(3 S)-LPP);LPP經(jīng)反式異構(gòu)和焦磷酸基團(tuán)離去兩個(gè)步驟形成松油基陽(yáng)離子(Terpinyl cation),通過(guò)冰片基二磷酸合成酶(Bornyl diphosphate synthases)環(huán)化和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)水解,最終生成龍腦[2-4]。

形態(tài)特征無(wú)顯著差別的植物由于所含代謝物組成或含量的差異,可被區(qū)分為不同的化學(xué)型[5]。化學(xué)型廣泛存在于藥用植物中,如廣藿香、香薷、薄荷及樟等。樟可劃分成龍腦型、樟腦型、桉油素型、異橙花叔醇型、檸檬醛、芳樟醇型、Sesquiterpene及Sesquiterpene alcohol等多種化學(xué)型[6]。化學(xué)型的不同會(huì)影響藥效的發(fā)揮和加工應(yīng)用方向。道地藥材是指特定地區(qū)生產(chǎn)的有效成分含量較高或配比最優(yōu)的中藥材。因此,研究藥用植物的化學(xué)型是有意義的。高含量右旋龍腦是龍腦樟與其他化學(xué)型樟的最大區(qū)別,植物精油成分和產(chǎn)量的定性、定量變化是由內(nèi)在因素或外部因素決定的,可從內(nèi)在因素對(duì)化學(xué)型進(jìn)行解析[7]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合代謝組學(xué),不僅可以挖掘差異關(guān)鍵基因,也能獲悉代謝產(chǎn)物,從而確定關(guān)鍵候選基因在代謝通路水平上差異基因的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為探究龍腦樟化學(xué)型形成機(jī)制提供了支持。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組對(duì)樟腦型樟與龍腦型樟進(jìn)行比較,為后續(xù)龍腦型樟資源開(kāi)發(fā)、品種選育及相關(guān)研究提供參考。

1 儀器與試劑

儀器:NanoDrop ND-1000(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)、Bioanalyzer 2100(Agilent,CA,USA)、氣相色譜儀(8890-7000 D,Agilent,CA,USA)、色譜柱為DB-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent,CA,USA)、萃取頭(120 μm DVB/CWR/PDMS,Agilent,CA,USA)、固相微萃取裝置(SPME Arrow,CTC Analytics AG,CH)、老化裝置(Fiber Conditioning Station,CTC Analytics AG,CH)、樣品加熱箱(Agitator,CTC Analytics AG,CH)、電子天平(MS 105 DU,METTLER TOLEDO,CHN)、球磨儀(MM 400,Retsch,CHN)。

試劑:TRIzol 試劑盒(Invitrogen,CA,USA)、氯化鈉(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、正己烷(色譜純,Merck,GER)、標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純,BioBioPha/Sigma-Aldrich,GER)、3-己酮(色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

龍腦樟由廣東萬(wàn)森生態(tài)科技發(fā)展有限公司提供,腦樟(Cinnamomumcamphorachvar. Camphor)來(lái)自廣東藥科大學(xué)藥圃。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取龍腦樟和腦樟無(wú)蟲(chóng)害、完整的成熟葉擦拭干凈,放入液氮速凍1 h后存放于-80 ℃冰箱保存,用于GC-MS和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。將腦樟組設(shè)定為Ctr組,龍腦樟組設(shè)為t組,具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品分類信息Table 1 Sample classification information

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1代謝組學(xué)分析

樣品制備:將葉片研磨混合均勻,每個(gè)樣本稱取約0.5 g于頂空瓶中,分別加入含有飽和NaCl溶液和10 μL(50 μg/mL)3-己酮的內(nèi)標(biāo)溶液,于全自動(dòng)頂空固相微萃取裝置進(jìn)行樣本萃取。

色譜條件:高純氦氣作為載氣,以1.2 mL/min恒流,進(jìn)樣口溫度250 ℃,溶劑延遲3.5 min。程序升溫:在40 ℃保持3.5 min,以10 ℃/min 升至100 ℃,再以7 ℃/min升至180 ℃,最后以25 ℃/min 升至280 ℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:離子源溫度為230 ℃,四級(jí)桿溫度為150 ℃,質(zhì)譜接口溫度280 ℃,電子能量70 eV,掃描方式為選擇離子檢測(cè)模式(SIM),定性定量離子精準(zhǔn)掃描。

表2 龍腦型樟和樟腦型樟測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Sequencing statistics of borneol-type and camphor-type camphor

表3 龍腦型樟和樟腦型樟拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of the splicing results of borneol-type and camphor-type camphor

數(shù)據(jù)分析:通過(guò)Mass Hunter軟件處理下機(jī)原始數(shù)據(jù),用于定性定量分析。檢索MWGC數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)代謝物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。對(duì)提取得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。選擇滿足|Fold Change|(FC)>2或<0.5,VIP>1條件的兩組間顯著差異代謝物。

2.2.2樣品總RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)及建庫(kù)測(cè)序

使用TRIzol 試劑盒提取樣品總RNA,利用NanoDrop ND-1000 對(duì)總RNA質(zhì)量和純度進(jìn)行質(zhì)控,再經(jīng)Bioanalyzer 2100對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)通過(guò)瓊脂糖電泳進(jìn)行驗(yàn)證合格后構(gòu)建cDNA文庫(kù),使用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。文庫(kù)的構(gòu)建和Illumina上機(jī)測(cè)序由杭州聯(lián)川生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2.2.3原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及組裝

將測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)(Raw data),使用Trinity 2.4.0軟件進(jìn)行預(yù)處理得到有效序列(Valid reads)。原始數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟如下:

1) 去接頭(Adaptor);

2) 切除序列中含有N部分(N:未知堿基);

3) 濾除低質(zhì)量堿基(Q<20部分);

4) 統(tǒng)計(jì)原始測(cè)序量(Raw Bases)、有效測(cè)序量(Clean Bases)、Q 20(質(zhì)量值≥20的堿基所占比例,測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.01)、GC含量(Clean Bases中G和C的數(shù)量總和占總堿基的百分比)。將獲得的Clean reads進(jìn)行De novo拼接,得到最終的Unigene。

2.2.4信息生物學(xué)分析

將完整的Unigenes與eggNOG、GO、KEGG、NR、Pfam及Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋,注釋比對(duì)閾值evalue<1×10-5。采用Salmon對(duì)Unigenes計(jì)算TPM (Transcript Per Million)進(jìn)行定量,采用R包edgeR對(duì)Unigenes進(jìn)行差異分析。其中,以p<0.05且|FC|>2為條件篩選差異基因。

3 結(jié)果與分析

3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

3.1.1測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與拼接結(jié)果

兩組樟經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后共獲得48.76 G原始數(shù)據(jù)量,325 086 988 bp原始序列,過(guò)濾掉低質(zhì)量的序列后得到316 959 130 bp有效序列。從表2可知,有效序列所占比例在95.98%～98.26%之間,Q 20所占比例均大于97%,GC堿基含量占總數(shù)量的46%～50%,平均含量為47.64%。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格,滿足后續(xù)的生物信息學(xué)分析要求。

對(duì)獲得的有效序列通過(guò)Trinity方法進(jìn)行組裝,共有32 550個(gè)Unigenes,N 50長(zhǎng)度為1 781 bp。此外,Transcript共68 125條,GC堿基占比43.45%,N 50(1 730 bp)是平均長(zhǎng)度的1.58倍,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄本完整度較高。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

3.1.2Unigenes功能注釋及分類

將Unigenes比對(duì)到不同數(shù)據(jù)庫(kù),注釋量占比從小到大依次為:43.16%(KEGG庫(kù))、45.93%(Swissprot庫(kù))、50.57%(Pfam庫(kù))、55.67%(GO庫(kù))、60.40%(eggNOG庫(kù))、66.39%(NR庫(kù)),其中,11 696個(gè)(36.27%)Unigenes可被所有數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到。各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果見(jiàn)表4。

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),共有4 172條Unigenes注釋到代謝通路中(圖1),主要參與碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)和能量代謝,這4條代謝共占注釋的60.20%。遺傳信息方面,同時(shí)參與翻譯(989條),蛋白質(zhì)折疊、分類和降解(783條),轉(zhuǎn)錄進(jìn)程(398條)。除此之外,信號(hào)轉(zhuǎn)換、環(huán)境適應(yīng)及運(yùn)輸和分解代謝均各占注釋的11%以上。

圖1 KEGG富集分析Fig.1 KEGG enrichment analysis

表4 Unigenes注釋的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Statistical results of Unigenes annotations

3.1.3差異表達(dá)基因分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選兩種樟的差異基因,標(biāo)準(zhǔn)為p<0.05且|FC|>2,共篩選出2 345個(gè)表達(dá)差異顯著基因,龍腦樟相對(duì)于腦樟上調(diào)表達(dá)的基因有882個(gè),下調(diào)的有1 553個(gè)。其中有156個(gè)基因是龍腦樟特有的,有105個(gè)基因是腦樟特有的,說(shuō)明兩種樟表達(dá)存在較大差異。基因的具體分布見(jiàn)圖2。

圖2 差異表達(dá)基因分布統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of differential gene distribution

3.1.4差異表達(dá)基因GO富集分析

將差異基因比對(duì)到GO庫(kù)進(jìn)行富集分析,共有1 850種基因分布到1 973條目中,其中有634個(gè)差異基因?qū)儆邶埬X樟相對(duì)腦樟顯著上調(diào)部分。圖3展示上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量位居前20的亞類GO分析結(jié)果:生物過(guò)程(Biological process)顯示龍腦樟差異表達(dá)基因與生物過(guò)程(Biological process)、轉(zhuǎn)錄(Transcription,DNA-templated)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Regulation of transcription,DNA-templated)密切相關(guān)。涉及分子功能(Molecular function) 亞類的差異表達(dá)基因主要富集在分子學(xué)功能(Molecular function,64個(gè))、ATP結(jié)合(ATP binding,78個(gè))和蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein binding,92個(gè))。細(xì)胞組分(Cellular component)下有208個(gè)基因體現(xiàn)在核(Nucleus),126個(gè)基因集中在細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm),質(zhì)膜(Plasma membrane)占有97個(gè)差異基因。

圖3 上調(diào)表達(dá)基因的GO功能富集分析Fig.3 GO functional enrichment analysis of up-regulated differentially expressed genes

3.1.5差異表達(dá)基因KEGG富集分析

為獲得兩組樟之間的代謝差異,對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析(圖4)。與腦樟相比,龍腦樟差異表達(dá)基因?qū)︻慄S酮生物合成通路影響最大,注釋到19個(gè)差異表達(dá)基因;而腦樟的差異表達(dá)基因顯著富集的途徑是果糖和甘露糖代謝,共注釋到15個(gè)差異表達(dá)基因。從代謝通路基因富集個(gè)數(shù)來(lái)看,龍腦樟最重要的通路是糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis),而腦樟是核糖體(Ribosome)。綜上可知,龍腦樟的差異表達(dá)基因主要與生物代謝物合成更為密切。

3.2 非靶向代謝組學(xué)研究

3.2.1代謝物差異篩選結(jié)果

采用GC-MS檢測(cè)兩種樟的化學(xué)成分,基于數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)樣本的代謝物進(jìn)行定性定量分析,共鑒定出867種代謝物。篩選|FC|>2或<0.5和VIP>1的代謝物,共得到468種顯著差異代謝物,其中顯著上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物分別為249種和219種。由圖5可知,龍腦樟與腦樟的整體代謝物存在較大差異,是進(jìn)行深入分析的基礎(chǔ)。

3.2.2OPLS-DA結(jié)果

正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)是一種更為科學(xué)的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法。圖6為OPLS-DA 驗(yàn)證模型,橙色代表隨機(jī)分組模型R2Y,紫色代表隨機(jī)分組模型Q2,黑色箭頭代表的值為原始模型的R2X,R2Y和Q2值。由圖6可知,R2Y=0.999、R2X=0.904、Q2=0.996,說(shuō)明該模型穩(wěn)定可靠,具有良好的預(yù)測(cè)能力。

3.2.3差異代謝物分析

由圖7可知,紅色代表代謝物含量上調(diào),綠色代表代謝物含量下調(diào)。結(jié)果表明,龍腦樟的差異代謝物主要與萜類、烴類相關(guān),而腦樟與雜環(huán)化合物、酯類代謝物有關(guān)。由表5可知,在龍腦樟中,龍腦是其主要化學(xué)成分且與腦樟差異較大,而腦樟中主要成分是樟腦。以上說(shuō)明兩種化學(xué)型樟主要成分差異明顯。

圖5 差異代謝物成分分析Fig.5 Differential metabolite components analysis

圖7 差異代謝物熱圖Fig.7 Differential metabolite heatmap

圖6 OPLS-DA驗(yàn)證模型Fig.6 Model verification of OPLS-DA

3.2.4差異代謝物通路分析

通過(guò) KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樟的代謝物進(jìn)行通路注釋分析(圖8),共有38個(gè)差異代謝可被注釋到。結(jié)果顯示,樟的分解代謝包括:檸檬烯和蒎烯降解(Limonene and pinene degradation)、硫代謝(Sulfur metabolism)、苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)、酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism)、甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)和代謝途徑(Metabolic pathways)等 9 個(gè)次級(jí)分類,其中有 17 種代謝物參與代謝途徑,有6種代謝物參與苯丙氨酸代謝途徑,有6種代謝物參與檸檬烯和蒎烯降解通路。合成代謝包括:單萜生物合成(Monoterpenoid biosynthesis)、次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、倍半萜和三萜生物合成(Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)、萜類骨架生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis)和各種生物堿的生物合成(Biosynthesis of various alkaloids)等 11 種2級(jí)分類。其中有 13 個(gè)代謝物參與次生代謝物的生物合成;有 6 個(gè)代謝物參與單萜生物合成。

表5 主要化學(xué)成分Table 5 Main differential metabolites

圖8 差異代謝物KEGG分類圖Fig.8 KEGG classification of differential metabolites

研究表明,萜類成分是影響化學(xué)型形成的主要原因。本實(shí)驗(yàn)的目的之一是探索2種不同化學(xué)型樟形成的相關(guān)代謝物,樣本間共有 9 種差異代謝物在萜類物質(zhì)合成通路中富集,有5個(gè)為顯著上調(diào)化合物,萜類物質(zhì)合成在龍腦樟組呈上調(diào)趨勢(shì)。同時(shí),通過(guò)分析代謝途徑的上、下調(diào)差異代謝物,發(fā)現(xiàn)龍腦樟組內(nèi)顯著上調(diào)的物質(zhì)為萜類和酸類化合物,說(shuō)明萜類物質(zhì)對(duì)龍腦樟的形成有重要作用。

4 萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因的挖掘和分析

結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析代謝基因、差異代謝化合物與代謝通路,挖掘與萜類差異代謝物相關(guān)的基因,根據(jù)生物合成表達(dá)模式,共篩選出6種差異代謝物。基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),有42個(gè)基因可調(diào)節(jié)單萜合成。其中參與萜類骨架生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis,Ko 00900)的基因有35個(gè),有57.14%在龍腦樟中上調(diào)。萜類骨架通路中大部分酶的基因表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(TPM>6),除了4種1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)和5種羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase,HMGR)Unigenes外。植物通過(guò)MEP和MVA途徑生產(chǎn)萜類通用底物,龍腦樟中MEP途徑中的Unigenes的表達(dá)量高于MVA途徑。除此之外,有18個(gè)二萜合酶Unigenes和4個(gè)參與倍半萜和三萜合酶的Unigenes在龍腦樟上調(diào)?？傮w而言,萜類骨架途徑中酶的高表達(dá)水平的結(jié)果與萜類化合物的高合成率一致,并可知兩種化學(xué)型中萜烯合成酶(Terpene synthase,TPS)基因的不同表達(dá)可能是其萜類成分不同的原因。單萜生物合成中,(-)-薄荷酮((-)-Menthone)、紫蘇醇(Perillyl alcohol)和右旋龍腦((+)-Borneol)代謝物在龍腦樟中顯著增加,益普二烯酮(Ipsdienone)、香芹酮((-)-Carvone)和右旋樟腦((+)-Camphor)代謝物顯著下降。

圖9 萜類生物合成的代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析Fig.9 Metabolomic and transcript analysis in the terpene biosynthetic

5 結(jié)論與討論

本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組,研究龍腦樟萜類物質(zhì)積累和關(guān)鍵酶基因的變化規(guī)律。龍腦樟與糖酵解/糖異生KEGG代謝通路密切相關(guān),而腦樟的形成與果糖和甘露糖代謝相關(guān),說(shuō)明基礎(chǔ)物質(zhì)參與樟化學(xué)型的形成。GC-MS共鑒定出214種萜類化合物,主要成分為單萜。單萜是樟葉片提取物中常見(jiàn)的化合物,在不同化學(xué)型中含量有差異。根據(jù)代謝成分可知,龍腦樟中右旋龍腦的含量(14.64%)高于腦樟(0.48%),而腦樟中的樟腦含量較高(12.78%)。由此可知,不同的主要單萜類化合物可能主導(dǎo)了兩種化學(xué)型之間的差異。多年來(lái),與萜類生物合成有關(guān)的基因在樟科植物中被廣泛研究。目前,已報(bào)道的龍腦樟萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因包括PMK[8]、萜烯合成酶1 (Terpene synthase 1,TPS 1)[9]、萜烯合成酶14(Terpene synthase 14,TPS 14)[10]、冰片脫氫酶(Borneol dehydrogenase,BDH 3)[11]等。PMK是MVA途徑中的限速酶,在樟的多個(gè)化學(xué)型中,發(fā)現(xiàn)龍腦樟中其表達(dá)量最高,CcTPS 14是龍腦樟積累右旋龍腦的主要酶[10]。

從兩組樟的轉(zhuǎn)錄組中共分離出106個(gè)可能參與萜類生物合成的表達(dá)單基因,有62個(gè)基因被注釋到萜類骨架生物合成這一通路中,其中差異表達(dá)基因8個(gè),DXS、香葉基香葉基二磷酸還原酶(Geranylgeranyl diphosphate reductase,chlP)、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)、異戊二烯半胱氨酸α-羧基甲基酯酶(Prenylcysteine alpha-carboxyl methylesterase,PCME)和蛋白法尼醇激酶(Farnesol kinase,FOLK)表達(dá)量上升。DXS作為MEP途徑的第一個(gè)限速酶,可催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合生成1-脫氧D-木酮糖5-磷酸,并經(jīng)一系列酶催化,最終生成通用底物DMAPP和異構(gòu)體IPP。研究表明,DXS是多種藥用植物萜類合成的關(guān)鍵基因,如北蒼術(shù)[12]、銀杏[13]、半枝蓮及夏枯草[14]等。在香樟中,單萜物質(zhì)的合成與DXS基因呈正相關(guān)[15]。在本研究中,DXS在龍腦樟顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明龍腦樟更傾向于通過(guò)MEP途徑合成萜類前體。GGPS是萜類骨架合成途徑的結(jié)構(gòu)酶,可催化底物IPP生成前體GPP[16]、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)[17]和法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP)。在牡丹[18]、柳杉[19]、地黃[20]等植物均發(fā)現(xiàn)該基因,與植物香味、單萜、倍半萜和三萜生物合成相關(guān)。GPP是單萜的直接前體,而右旋龍腦屬于環(huán)狀單萜,該基因在龍腦樟組明顯上升表達(dá),與右旋龍腦在龍腦樟中積累相協(xié)調(diào),進(jìn)而說(shuō)明其在龍腦生物合成中發(fā)揮著重要作用。龍腦樟組FOLK顯著下調(diào),這與曹瑞蘭等[21]發(fā)現(xiàn)芳樟(Cinnamomumcamphoravar. linaloolifera Fujita．)內(nèi)FOLK表達(dá)遠(yuǎn)低于雜樟的結(jié)果一致。根據(jù)差異基因在萜類骨架生物合成的分布情況,與樟腦型樟相比,龍腦樟可產(chǎn)生多類型的萜類物質(zhì)。

單萜合酶(Monoterpene synthases, mono-TPS)是單萜生物合成的關(guān)鍵酶,決定了單萜結(jié)構(gòu)的多樣性。在單萜生物合成中,(-)-α-松油醇合酶((-)-alpha-terpineol synthase)在龍腦樟組內(nèi)表達(dá)量顯著上升,該酶可與被chlP催化生成的前體GPP反應(yīng)生成α-萜品醇。研究表明,單萜合酶CcTPS 1催化GPP得到酶促反應(yīng)產(chǎn)物(+)-冰片基二磷酸,產(chǎn)物進(jìn)一步脫磷酸化,可得到右旋龍腦[9]。

除以上上調(diào)差異基因外,4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase4,ispE)、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase, gcpE)、羥甲基戊二酰輔酶A合酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, HMGCS)、異戊二烯半胱氨酸氧化酶(Prenylcysteine oxidase,PCYOX1)、蛋白質(zhì)-S-異戊二烯半胱氨酸 O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein-S-isoprenylcysteine O-methyltransferase,ICMT)、STE 24 內(nèi)肽酶(STE 24)和異戊二烯蛋白肽酶(prenyl protein peptidase,RCE1)亦在龍腦樟組內(nèi)輕微上調(diào)。這些調(diào)控酶主要分布在玉米素生物合成和單萜化合物生成,而右旋龍腦屬于含氧單萜類成分,說(shuō)明在龍腦樟內(nèi)可通過(guò)上調(diào)相關(guān)途徑提高右旋龍腦的含量。