高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中氧氟沙星殘留

◎ 高倩妮，魏超田，陸 寧，姚夢(mèng)靖，周曉龍

（1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.藥食同源功能食品亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800）

由于蜂蜜具有保健作用的特殊性，其質(zhì)量問(wèn)題被廣大消費(fèi)者關(guān)注。為了避免蟲(chóng)害，蜂農(nóng)會(huì)給蜜蜂身上噴曬抗菌藥——氧氟沙星，氧氟沙星是屬于喹諾酮類(lèi)中的一種具有廣譜性的抗菌藥[1]，蜂蜜在養(yǎng)殖加工過(guò)程中如檢測(cè)出氧氟沙星則被判定不合格[2]。近年來(lái)，蜂蜜中喹諾酮類(lèi)檢出率也有逐年增加的趨勢(shì)，學(xué)術(shù)研究者不斷探索蜂蜜中氧氟沙星的檢測(cè)方法[3]。目前，測(cè)定氧氟沙星殘留量的方法有免疫芯片法[4-5]、氣相色譜法[6]、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用法[7]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法[8]。質(zhì)譜法的檢出限最低，但操作復(fù)雜、煩瑣、耗時(shí)且設(shè)備條件和成本大。因此，質(zhì)譜法難以普及。由于蜂蜜有一定的粘稠特性，所以，不能使用畜產(chǎn)品的前處理方法。本文研究前處理方法，固相萃取蜂蜜中的氧氟沙星，探究流動(dòng)相組成、流速和比例，研究開(kāi)發(fā)高效液相色譜法測(cè)定氧氟沙星，其方法簡(jiǎn)單、成本低、效率高、實(shí)用性強(qiáng)，為快速檢測(cè)蜂蜜產(chǎn)品中的目標(biāo)物含量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)液（100 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司），乙腈（色譜純）、無(wú)水硫酸鎂、甲酸、乙酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀均為國(guó)藥分析純，蜂蜜市售。

1.2 儀器設(shè)備

HPLC（世爾科技有限公司）；固相萃取儀（天津東康科技有限公司）；FN-12W 型氮吹儀（天津富達(dá)科技有限公司）；YP-5006 型百分之一天平（上海越平科技儀器有限公司）；AcclaimTMPolarAdvantage II C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取200 μL 氧氟沙星標(biāo)液（100μg·mL-1），用0.2%甲酸水溶液定容至1 mL 配制成20.00μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備于冰箱中備用。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱為C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)，450 nm 的發(fā)射波長(zhǎng)；柱溫為30 ℃；流速為1.5 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相體積比例為13:87（流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.2%甲酸水溶液）。依據(jù)以上色譜條件，檢測(cè)流動(dòng)相種類(lèi)（乙腈/0.2%甲酸、0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈），流速及流動(dòng)相比例，樣品不同前處理等因素對(duì)氧氟沙星分離效果的影響，確定最終色譜條件，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定、精密度實(shí)驗(yàn)、回收率測(cè)定考察儀器方法的精密性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

1.3.3 蜂蜜樣品處理

蜂蜜稀釋液的選擇，一般樣品分別用水、0.02 mol·L-1的氫氧化鈉和Mallvaine pH 為4.0 的緩沖液溶解蜂蜜，再用0.5%乙酸乙腈提取氧氟沙星。用2 mL 甲醇、磷酸緩沖鹽分別預(yù)淋萃取柱，上清液過(guò)柱，甲醇洗脫，吹至近干，定容至2 mL，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜。

研究提取液對(duì)氧氟沙星提取量的影響，提取液為0.05 mol·L-1磷酸緩沖鹽、0.5%乙酸的乙腈和乙腈+水（8:2）混合溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相為磷酸溶液/三乙胺-乙腈時(shí)，氧氟沙星出峰時(shí)間較為延遲，為10.776 min，且基線(xiàn)不穩(wěn)定，雜峰較多，分離效果不好；流動(dòng)相為甲酸—乙腈時(shí)，氧氟沙星出峰時(shí)間為7.773 min，節(jié)約時(shí)間且基線(xiàn)穩(wěn)定，有對(duì)稱(chēng)尖銳的峰型，分離效果較好，信噪比更高，定甲酸水溶液和乙腈（87:13）為選擇流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，時(shí)間為18 min。

2.1.2 流速優(yōu)化

目標(biāo)物出峰時(shí)間隨流速增加而縮短，出峰時(shí)間為6.775 min，此時(shí)流速為1.8 mL·min-1，峰前有拖尾的狀況，有明顯現(xiàn)象，基線(xiàn)不穩(wěn)；流速為1.2 mL·min-1時(shí)，峰前拖尾現(xiàn)象，明顯基線(xiàn)不穩(wěn)，出峰時(shí)間為8.626 min；流速為1.5 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間為7.648 min，出現(xiàn)無(wú)拖尾現(xiàn)象且鋒型較為尖銳對(duì)稱(chēng)的峰圖，因此，最終選擇1.5 mL·min-1的流速。

2.2 優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件

2.2.1 確定初方法

以磷酸緩沖鹽、乙酸的乙腈和乙腈+水（8:2）混合溶液為蜂蜜中氧氟沙星的提取液，同體積添加的3種提取液中的氧氟沙星含量經(jīng)高效液相測(cè)定結(jié)果分別為0、1.152 0 和0.951 9 ng·g-1，故選擇氫氧化鈉溶液作為蜂蜜樣品中稀釋液，乙酸的乙腈溶液作為蜂蜜稀釋液中氧氟沙星的提取液。

2.2.2 方法的進(jìn)一步確定與優(yōu)化

研究分析兩因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果分析表見(jiàn)表1。由表1 可知，氫氧化鈉: 蜂蜜=1:1，蜂蜜: 乙酸乙腈=1:5 時(shí)，提取效果最佳，提取量為1.612 ng·g-1。

表1 氫氧化鈉和乙酸乙腈溶液對(duì)提取氧氟沙星的影響表ng·g-1

2.3 儀器方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

將氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液的濃度配制成0.016、0.032、0.080、1.000、10.000、20.000 μg·mL-1。縱坐標(biāo)（Y)為峰面積，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣濃度（X)，擬合標(biāo)曲方程為：Y=737 745.075 9X-33 501.592 5，R2=0.997 6。在0.016～20.000 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度與檢出限

測(cè)定6 次，吸取標(biāo)液0.032 μg·mL-1得到組分為2.24%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。添加0.8 μg·kg-1標(biāo)液于空白蜂蜜基質(zhì)，信噪比（S/N)＞10，說(shuō)明定量限可達(dá)到0.8 μg·kg-1，該方法可以滿(mǎn)足分析要求。

2.3.3 回收率實(shí)驗(yàn)

取100 μL 的0.05、0.10 和0.5 μg·mL-1的標(biāo)液放入5 g 蜂蜜空白樣中，做3 次加標(biāo)回收重復(fù)試驗(yàn)?；厥章蕿?4.38%～99.41%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.25%，滿(mǎn)足線(xiàn)性分析要求。

3 結(jié)語(yǔ)

將方法應(yīng)用于市場(chǎng)，在市場(chǎng)上的蜂蜜樣品中選取5 種品牌3 個(gè)種類(lèi)的椴樹(shù)蜂蜜、洋槐蜂蜜及老蜂蜜檢測(cè)，共抽檢了5 份。優(yōu)化后的色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-2%甲酸水溶液（13:87），1.5 min·L-1的流速，35 ℃的柱子溫度，280 nm，450 nm 發(fā)射波長(zhǎng)。此方法條件下，檢測(cè)氧氟沙星0.8 μg·kg-1的檢出限，在0.016 ～20.000 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)氧氟沙星測(cè)定呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，加標(biāo)回收率為84.38%～99.41%，本方法能夠滿(mǎn)足殘留分析的要求。一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確又快捷的方法，檢測(cè)蜂蜜及類(lèi)似產(chǎn)品中可能存在的氧氟沙星殘留量，一定程度上可以保障蜂蜜產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)。