響應(yīng)面優(yōu)化蝦殼抗菌肽酶解工藝

◎ 姜雯雯，陳曉燕，曾 威，馬丹丹，熊茫茫，付樂勝

（江西科技學(xué)院，江西 南昌 330098）

隨著耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，開發(fā)新的藥物對抗耐藥結(jié)核菌株感染顯得尤為重要，而抗菌肽作為“天然抗生素”有很大的開發(fā)潛力[1]?？咕腫2-4]屬于生物活性肽，具有廣譜抗菌性、種類較多、抗菌活性較高、無污染及無使用殘留的顯著優(yōu)勢。生物活性肽[5]基于其食源性的特點，且具有無毒、低過敏性、高安全性等優(yōu)點，因此，抗菌肽在抗生素耐藥、美容領(lǐng)域以及抗腫瘤治療方面有較大的研究開發(fā)價值和應(yīng)用前景。目前，雖有對水產(chǎn)生物蝦抗菌肽的研究，但主要集中在對南極磷蝦整蝦或蝦粉的研究，對蝦殼、蝦仁分開研究較少。因此，本課題選取基圍蝦作為食源性抗菌肽的研究對象，對蝦殼抗菌肽進(jìn)行比較研究，充分利用蝦殼這種高產(chǎn)的下腳料，以期創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價值。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

蝦殼來源菜市場新鮮的基圍蝦；胰蛋白酶（≥50000 U·g-1）購于Thermo Fisher Scientif ic；甲醛、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。高速離心機(jī)(TDL-60B)，購于上海安亭科學(xué)儀器廠；pH 機(jī)（DDS-307），購于上海儀電科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋(HH-6)，購于上海皓莊儀器有限公司；堿式滴定管(Ex20)，購于廣州天博化玻儀器有限公司；Milli-Q 超純水機(jī)，購于美國 Millipore 公司。

1.2 試驗內(nèi)容

1.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)，以酶解溫度、酶解時間、初始pH 值作為對酶解效果的三因素，利用Box-Behnken 設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，將酶解液中氨基氮含量作為評價指標(biāo)，建立二次響應(yīng)面分析模型圖，對酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化因素與水平見表1。試驗數(shù)據(jù)利用 Design-Experpt10.0.0 和Excel97-2013 進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

1.2.2 酶解試驗

以整蝦殼粉為原材料，選取胰蛋白酶作為酶解的生物酶，配置50 mL 的酶解液，其中，酶解液濃度為8.0%，在不同的酶解條件下（酶解溫度、酶解時間、初始pH 值)進(jìn)行酶解，隨后將酶解液于100 ℃下水浴加熱10 min，終止酶解反應(yīng)，冷卻至室溫，于離心機(jī)8 000 r·min-1條件下5 ℃離心分離10 min，收集上清液，以酶解液中氨基氮含量為指標(biāo)，采用甲醛電位滴定法測定各酶解液中氨基氮含量，比較酶解效果。

1.2.3 蝦殼中氨基氮含量的測定

取基圍蝦蝦殼，并制成蝦粉，采用甲醛電位滴定法，利用式（1）計算蝦殼中氨基氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在測定氨基氮含量之前，需將所得酶解液放置100 ℃的水浴中10 min 終止酶解反應(yīng)。取酶解溶液15 mL，用0.05M NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至8.2，隨后加5 mL 甲醛溶液，再用NaOH 溶液調(diào)pH 值至9.2，記錄NaOH 消耗量為V1，以純化水作為對照組，同樣操作調(diào)pH 值至9.2并記錄消耗量為V2。利用式（1）計算氨基氮含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果

以酶解溫度（A）、酶解時間（B）、初始pH（C）為自變量，氨基氮含量（R）為響應(yīng)值，通過Box-Behnken 進(jìn)行17 次響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化酶解提取抗菌肽工藝。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果表

2.2 回歸模型分析

使用Design-Expert 對表2 中的響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合統(tǒng)計，并對回歸模型進(jìn)行誤差分析、可信度分析。表3 為回歸模型的方差分析及顯著性試驗表。由表3 可知：該模型的P 值＜0.000 1，模型整體達(dá)到極顯著水平。失擬項P 值0.277 0＞0.05 不顯著，表示該模型與純誤差關(guān)聯(lián)不顯著，模型比較穩(wěn)定，F(xiàn)值1.86 表明該模型合理。一次項A、B、C，交互項AC、BC 及二次項A2、B2、C2對酶提取效果極顯著，交互項AB 對酶解結(jié)果影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性試驗表

表4 為回歸方程的可信度分析表。表4 中顯示該模型的變異系數(shù)CV＜40%，表明試驗設(shè)計可信度和精確度比較高。模型的校正決定系數(shù)R2＝0.996 0，表明不到1% 的響應(yīng)面變異無法利用該模型解釋，調(diào)整后的決定系數(shù)Adjusted R2 ＝0.990 9、預(yù)測擬合度Predicted R2＝0.960 3，說明該回歸模型誤差較小、擬合度較好。通過分析可知：該響應(yīng)面試驗是可行的，該模型能夠較好地對抗菌肽酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表4 回歸方程的可信度分析表

所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合得二次多項回歸方程：

2.3 響應(yīng)曲面分析

圖1 為各影響因素交互作用對氨基氮含量影響的響應(yīng)面圖。從圖1（a）可知，當(dāng)酶解時間不變時，氨基氮含量隨著酶解溫度的升高先增加，達(dá)到一定值后逐漸下降；而在酶解溫度不變的條件下，隨著酶解時間的升高，氨基氮含量先升高，達(dá)到極大值后急劇下降，表明在一次項中酶解時間比酶解溫度對氨基氮的影響更顯著。從圖1（b）可看出，氨基氮含量隨著初始pH 和酶解溫度的升高都表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，但可以看出初始pH 對酶解效果的影響更大些。從圖1（c）可知，在一次項中初始pH 比酶解時間對氨基氮含量的影響更大且交互作用顯著。

使用Design-Experpt 數(shù)據(jù)軟件優(yōu)化分析功能，在基礎(chǔ)試驗性因素下取得范圍內(nèi)氨基氮含量的響應(yīng)值最大值，從中得到的最佳條件為：酶解溫度44.565 ℃，酶解時間8.531 h，pH 為7.888，此時預(yù)測得出酶解液中氨基氮含量的最大值為16.536 mg·g-1。為實際生產(chǎn)的可行性，選取最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度44.5 ℃，酶解時間8.5 h，pH 為7.9，在此條件下重復(fù)試驗3 次，實際測得的氨基氮為（15.98±0.95） mg·g-1。理論預(yù)測值與實際值接近，重復(fù)性好，說明響應(yīng)面法優(yōu)化抗菌肽酶解工藝是可行的。

3 討論

食源性生物活性肽的來源范圍在逐漸擴(kuò)大，隨著人們對更多海洋生物活性物質(zhì)的深入研究，其在抗生素耐藥、美容領(lǐng)域以及抗腫瘤治療方面的研究與應(yīng)用前景越來廣闊。本課題選取基圍蝦殼進(jìn)行食源性抗菌肽的研究，充分利用蝦殼這種高產(chǎn)低值的下腳料，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化基圍蝦酶解工藝，獲得最優(yōu)提取條件為：酶解溫度44.5 ℃，酶解時間8.5 h，pH 為7.9，此時酶解液中氨基氮含量為（15.98±0.95） mg·g-1，與模型理論預(yù)測值16.536 mg·g-1基本一致，旨在為后續(xù)基礎(chǔ)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)，實現(xiàn)基圍蝦資源高附加值利用。