托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞免疫指標(biāo)變化特點(diǎn)*

汪達(dá)青,朱珈漩,王芳,司馬赟,王卓,何春燕

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇蘇州215004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一類基于滑膜關(guān)節(jié)慢性炎癥的自身免疫病,通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹和壓痛,進(jìn)而累及全身器官。為避免患者進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷,降低患者致殘率及死亡率,RA診斷明確后需盡早使用合理藥物治療,以達(dá)到緩解病情、控制進(jìn)程的目的。臨床常用的改善RA癥狀的藥物包括抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥和炎性細(xì)胞因子抑制劑[1]。近年來,IL-6受體抑制劑托珠單抗由于其安全性高、療效好在臨床廣泛應(yīng)用。本研究就托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療前后RA患者細(xì)胞因子水平及外周血淋巴細(xì)胞亞群比例進(jìn)行分析,探討治療對(duì)患者各免疫指標(biāo)的影響,以期為其療效觀察提供更靈敏、準(zhǔn)確的參考。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 納入蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院2021年12月—2022年7月RA患者22例,其中男性2例,女性20例,年齡(56.6±12.4)歲,年齡范圍31～72歲,病程(6.65±5.95)年,病程范圍0.7～20年。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡20～75歲;(2)符合2010年ACR/EULAR類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[2];(3)臨床及實(shí)驗(yàn)室信息完整;(4)托珠單抗以8 mg/kg每4周靜脈滴注1次,聯(lián)合甲氨蝶呤每周10 mg口服,治療12周。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)同時(shí)接受除托珠單抗和甲氨蝶呤外其他抗風(fēng)濕藥物聯(lián)合治療;(2)同時(shí)患有其他自身免疫病;(3)活動(dòng)性病毒和細(xì)菌感染;(4)惡性腫瘤患者;(5)合并嚴(yán)重心腦血管疾病;(6)嚴(yán)重肝腎功能不全者。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(JD-HG-2022-62)。

1.2疾病活動(dòng)度評(píng)估 采集患者年齡、性別、病程等個(gè)體特征資料,以及治療前、后C反應(yīng)蛋白(CRP)與血細(xì)胞沉降率(ESR)數(shù)據(jù),計(jì)算DAS28評(píng)分,計(jì)算公式為:DAS28=[0.56×sqrt(T28)+0.28×sqrt(SW28)+0.70×Ln(ESR)]×1.08+0.16,其中T28表示觸痛的關(guān)節(jié)數(shù),SW28表示關(guān)節(jié)腫脹數(shù),sqrt為開平方根,Ln為取自然對(duì)數(shù),根據(jù)DAS28評(píng)分和CRP變化評(píng)價(jià)治療前后疾病活動(dòng)程度[3]。

1.3主要儀器與試劑 BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀、人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)560484)、10×Lysing緩沖液(貨號(hào)555899)、熒光標(biāo)記單克隆抗體(美國(guó)BD公司);PBS緩沖液(中國(guó)Biosharp公司,貨號(hào)BL302A)。

1.4標(biāo)本采集與制備 采集治療前、后患者空腹外周靜脈血,肝素抗凝管采血量為4 mL,促凝血清管采血量為3.5 mL。肝素抗凝血采集后立即進(jìn)行流式檢測(cè),促凝管靜置1 h后3 000 r/min離心15 min,分離血清于4 ℃保存,每周統(tǒng)一測(cè)定細(xì)胞因子。

1.5流式檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群 移液器吸取50 μL肝素抗凝血至流式管底部,加入相應(yīng)流式抗體混勻,室溫避光反應(yīng)15 min,加入紅細(xì)胞裂解液2 mL,避光裂解5 min,離心,棄上清液,PBS洗滌2次后細(xì)胞沉淀以300 μL PBS懸浮,上機(jī)檢測(cè),檢測(cè)方案如下。(1)T淋巴細(xì)胞亞群。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells, Treg):CD3+CD4+CD25+CD127-;CD4+/CD8+初始T細(xì)胞(CD4+/CD8+naive T cells,CD4+/CD8+TN):CD45+CD3+CD4+/CD8+CD45RA+CD197+;CD4+/CD8+中央記憶T細(xì)胞(CD4+/CD8+central memory T cells,CD4+/CD8+TCM):CD45+CD3+CD4+/CD8+CD45RA-CD197+;CD4+/CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞(CD4+/CD8+effector memory T cells,CD4+/CD8+TEM):CD45+CD3+CD4+/CD8+CD45RA-CD197-;CD4+/CD8+活化中央記憶T細(xì)胞(CD4+/CD8+activated central memory T cells, acti-CD4+/CD8+TCM):CD38+HLA-DR+CD4+/CD8+TCM;CD4+/CD8+活化效應(yīng)記憶T細(xì)胞(CD4+/CD8+activated effector memory T cells,acti-CD4+/CD8+TEM):CD38+HLA-DR+CD4+/CD8+TEM。(2)樹突狀細(xì)胞亞群。髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells,mDC):Lin-CD45+DR+CD11c+CD123-;漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC):Lin-CD45+DR+CD11c-CD123+;活化髓樣樹突狀細(xì)胞(activated-myeloid dendritic cells,acti-mDC):CD40+mDC;活化漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(activated-plasmacytoid dendritic cells,acti-pDC):CD40+pDC。(3)B淋巴細(xì)胞亞群。初始B細(xì)胞(naive B cells,NBCs):CD45+CD19+CD27-;記憶B細(xì)胞(memory B cells,MBCs):CD45+CD19+CD27+;調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells,Breg):CD45+CD19+CD24+CD38+;漿母細(xì)胞(plamsablasts,PBs):CD45+CD19+CD27+CD38+。

1.6流式CBA法測(cè)定血清細(xì)胞因子水平 按要求混合捕獲磁珠,離心后在血清增強(qiáng)緩沖液中重懸備用;同時(shí)復(fù)溶細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品,依據(jù)1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512梯度在流式管中倍比稀釋,并設(shè)置空白管;分別吸取50 μL的混合磁珠、PE檢測(cè)試劑、樣本/標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)流式管中,室溫避光反應(yīng)3 h,加入1 mL洗滌緩沖液終止結(jié)合,離心吸棄上清液后再以300 μL洗滌緩沖液重懸磁珠,上機(jī)檢測(cè)PE熒光強(qiáng)度。使用FCAP Array軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1治療前后RA患者疾病活動(dòng)度比較 與治療前比較,RA患者經(jīng)托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療后DAS28評(píng)分由3.03±1.22下降至2.47±1.31(t=2.25,P=0.035),CRP由5.75(5.20,17.4)mg/L下降至5.30(5.18,6.13)mg/L(z=-2.454,P=0.014),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2治療前后RA患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例比較 結(jié)果表明,治療后患者外周血中活化記憶T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),其中包括活化中央記憶CD4+T細(xì)胞(acti-CD4+TCM)、活化效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞(acti-CD4+TEM)、活化中央記憶CD8+T細(xì)胞(acti-CD8+TCM)、活化效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞(acti-CD8+TEM),流式結(jié)果見圖1;但外周CD4+/CD8+初始T細(xì)胞(CD4+TN、CD8+TN)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、中央記憶T細(xì)胞(CD4+TCM、CD8+TCM)、效應(yīng)記憶T細(xì)胞(CD4+TEM、CD8+TEM)較治療前無(wú)明顯變化(P>0.05),見表1。

圖1 托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療前后活化記憶T細(xì)胞比例變化

表1 治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例比較

2.3治療前后外周血樹突狀細(xì)胞亞群及B淋巴細(xì)胞亞群比例比較 經(jīng)托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療后,患者外周血中髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)比例明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其他樹突狀細(xì)胞亞群如漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)、活化漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(acti-pDC)、活化髓樣樹突狀細(xì)胞(acti-mDC)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B淋巴細(xì)胞各個(gè)亞群包括初始B細(xì)胞(NBCs)、記憶B細(xì)胞(MBCs)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)和漿母細(xì)胞(PBs)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

表2 治療前后外周血B淋巴細(xì)胞亞群和樹突狀細(xì)胞比例比較(%,n=22)

2.4治療前后血清細(xì)胞因子含量比較 經(jīng)托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療后,患者血清中IL-6水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而其他細(xì)胞因子如TNF-α、IL-10、IL-2均有一定程度的下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 治療前后血清細(xì)胞因子含量比較[pg/mL,M(P25,P75),n=22]

3 討論

RA作為一種常見的慢性自身免疫病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究表明,RA發(fā)病受環(huán)境以及遺傳等因素影響,雖然其具體機(jī)制尚未闡明,但免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞(成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞)及其分泌的細(xì)胞因子在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。RA產(chǎn)生的核心在于自身抗體類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic peptide containing citrulline,ACPA)的形成。RF和ACPA由B淋巴細(xì)胞分泌,與瓜氨酸化蛋白結(jié)合后經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(DC為主)遞呈給T細(xì)胞,觸發(fā)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-2的產(chǎn)生,導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖及炎癥部位破骨細(xì)胞生成,從而造成軟骨和關(guān)節(jié)損傷[5]。在此過程中,T淋巴細(xì)胞發(fā)揮主要作用。研究表明,人T細(xì)胞可分為幼稚T細(xì)胞(naive T cells,TN)、中央記憶細(xì)胞(central memory T cells,TCM)和效應(yīng)記憶細(xì)胞(effector memory T cells,TEM),其中TEM細(xì)胞和TCM細(xì)胞在血液中循環(huán)并靶向次級(jí)淋巴組織,遇到抗原時(shí)可轉(zhuǎn)換為活化的T細(xì)胞。尤其是TEM細(xì)胞,是RA中自身免疫記憶T細(xì)胞的主要類型,具有即時(shí)效應(yīng)功能[6]。此外,T細(xì)胞亞群中的Treg細(xì)胞能夠通過分泌的IL-10及表面免疫抑制分子,減弱抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈功能,負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),但該作用在RA中被抑制,B細(xì)胞亞群中的Breg細(xì)胞也具有類似的作用[7]。

鑒于RA復(fù)雜的細(xì)胞及細(xì)胞因子作用網(wǎng)絡(luò),近年來,靶向RA免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的生物制劑層出不窮,其中以靶向TNF-α的英夫利昔單抗和IL-6受體的托珠單抗臨床應(yīng)用最為廣泛[8]。托珠單抗作為首個(gè)針對(duì)IL-6R的人源化單克隆抗體,可以通過靜脈或皮下注射,抑制IL-6R介導(dǎo)的所有信號(hào),單獨(dú)或聯(lián)合甲氨蝶呤治療抗風(fēng)濕藥應(yīng)答不足的成人中重度活動(dòng)性RA[9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),托珠單抗的治療能夠普遍減輕患者炎癥,降低患者DAS28評(píng)分,且該作用主要是通過減少炎癥因子和炎癥細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的,抑炎指標(biāo)Treg、Breg、IL-10在此過程中沒有變化。這說明托珠單抗與甲氨蝶呤聯(lián)合治療通過抑制過度活化的免疫應(yīng)答而不是上調(diào)抑制性免疫應(yīng)答發(fā)揮治療作用。這從RA的發(fā)病機(jī)制上可以解釋。研究證實(shí),IL-6R介導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路通過促進(jìn)B細(xì)胞活化和T細(xì)胞增殖,誘發(fā)或加重RA病變[10]。托珠單抗與甲氨蝶呤聯(lián)合治療可有效降低RA病人血清中IL-6的產(chǎn)生,從源頭上減少IL-6R介導(dǎo)JAK-STAT信號(hào)通路的活化,從而減輕炎癥反應(yīng)。該治療方案可以有效降低外周活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞比例,即活化記憶T細(xì)胞,包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞,其中以CD4+T細(xì)胞的降低更為顯著。此外,治療后mDC的比例也明顯減少。mDC主要發(fā)揮抗原提呈作用,mDC的減少可能意味自身抗原向記憶T細(xì)胞的提呈減少,進(jìn)一步導(dǎo)致T細(xì)胞活化程度降低,有利于疾病好轉(zhuǎn)。托珠單抗與甲氨蝶呤聯(lián)合治療對(duì)外周血中B淋巴細(xì)胞亞群的影響較小,這可能與B細(xì)胞分群不夠精細(xì)有關(guān),過去有研究表明托珠單抗治療使IgD-CD27-記憶B細(xì)胞比例降低到正常水平,但不影響其他B細(xì)胞亞群[11]。同時(shí)在本研究中,更多女性患者接受托珠單抗聯(lián)合甲氨蝶呤治療;且相關(guān)文獻(xiàn)表明性別對(duì)托珠單抗治療效果沒有影響,男女RA患者外周血中免疫細(xì)胞分布比例沒有明顯差異[12],因此認(rèn)為在本研究中性別不影響結(jié)果的判斷。

綜上所述,托珠單抗延緩RA的進(jìn)展更依賴于其對(duì)活化記憶T細(xì)胞和IL-6的抑制作用,而對(duì)B細(xì)胞亞群以及其他炎性因子的抑制作用不顯著。這有助于臨床針對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療,對(duì)于記憶T細(xì)胞過度活化和IL-6升高的患者,托珠單抗的使用則更加有效。