慢性乙型肝炎患者HBsAg和HBsAb共存機(jī)制研究進(jìn)展

楊麗楠,常樂(lè),李志艷,閆存玲,曾爭(zhēng),馮珍如

(1.太原市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,太原030012;2.北京大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗(yàn)科,b.感染疾病科,北京100034)

機(jī)體乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽(yáng)性表示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染,乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B surface antibody,HBsAb)的出現(xiàn)表示具備對(duì)HBV的免疫力,預(yù)示著HBV的清除和HBsAg的消失。然而,臨床上存在一小部分慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者,其血清中能夠同時(shí)檢測(cè)到HBsAg和HBsAb,即HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性者,為臨床診斷和判定CHB患者的疾病狀態(tài)帶來(lái)困擾。

CHB患者HBsAg和HBsAb共存機(jī)制的既往研究主要集中在HBV S基因突變、不同血清型HBV感染、HBV再活動(dòng)以及HBsAg/HBsAb免疫復(fù)合物的形成[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HBsAg新增N-糖基化突變、HBV準(zhǔn)種多樣性、宿主遺傳基因的突變和免疫組庫(kù)表達(dá)的差異也可能與HBsAg和HBsAb的共存有關(guān)。本文旨在綜述CHB患者HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)共存機(jī)制的新近研究。

1 HBsAg新增N-糖基化突變

病毒包膜N-糖基化是一種翻譯后修飾,其修飾位點(diǎn)需有一致的氨基酸序列N-X-S/T(N為天冬酰胺,X為脯氨酸以外的任意氨基酸,S為絲氨酸,T為蘇氨酸),在病毒的生物合成、穩(wěn)定性、抗原性和傳染性方面發(fā)揮重要作用。HBsAg蛋白在分泌過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)N-糖基化修飾,尤其是sN146位的糖基化修飾,其對(duì)HBsAg分泌最為重要,能夠幫助HBsAg蛋白正確折疊,增加其穩(wěn)定性和親水性,維持其抗原性[2]。

有研究報(bào)道顯示,HBsAg新增的N-糖基化可導(dǎo)致過(guò)度糖基化,掩蓋HBsAg抗原表位“a”決定簇,降低中和抗體的結(jié)合能力,造成免疫逃逸[3-4]。盧姍姍等[5]研究發(fā)現(xiàn),HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性患者HBsAg新增N-糖基化突變率顯著高于HBsAg單陽(yáng)性患者,體外試驗(yàn)顯示HBsAg抗原性降低,與中和抗體HBsAb結(jié)合能力下降,造成血清中HBsAg和HBsAb共存。另外,CHB患者HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)者,HBV S基因主要親水區(qū)(major hydrophilic region,MHR)新增的N-糖基化突變可能是肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生的危險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)[6]。

2 HBV準(zhǔn)種多樣性

在HBV復(fù)制過(guò)程中,由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能,無(wú)法對(duì)錯(cuò)配的堿基進(jìn)行校正,同時(shí)HBV的復(fù)制能力極強(qiáng),從而導(dǎo)致HBV基因組高度變異,在HBV感染者體內(nèi)形成一群基因序列相似但又存在差異的病毒株,稱之為準(zhǔn)種(quasispecies)[7]。既往研究只從部分HBV基因組的角度來(lái)研究HBsAg和HBsAb的共存,難以全面反映HBsAg和HBsAb共存與HBV基因組間的關(guān)系。

高通量測(cè)序技術(shù)可以研究HBV基因組的全長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)種特征。Zhou等[8]評(píng)估HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)實(shí)驗(yàn)組和HBsAg單陽(yáng)對(duì)照組的HBV全基因組準(zhǔn)種特征,發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)實(shí)驗(yàn)組HBV準(zhǔn)種多樣性顯著增加,且觀察到更多的陽(yáng)性選擇位點(diǎn)、突變和缺失,突變多位于人類白細(xì)胞抗原Ⅰ類分子(human leukocyte antigen Ⅰ,HLA Ⅰ)、HLA Ⅱ或B細(xì)胞表位,表明積累突變可能為HBV提供逃避宿主免疫攻擊的機(jī)會(huì)。

準(zhǔn)種的變異譜在疾病的不同時(shí)期具有不同的適應(yīng)度[9]。Wang等[10]利用二代測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù),分析HBV基因C型的HBsAg和HBsAb共存患者HBV S區(qū)準(zhǔn)種特征,發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBsAb共存患者組與HBsAg單陽(yáng)組準(zhǔn)種特征有顯著差異,HBV S區(qū)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位的免疫原性和主要親水區(qū)(main hydrophilic region, MHR)的抗原性均下降,且HBsAg和HBsAb共存的CHB患者與HBV相關(guān)HCC患者之間的準(zhǔn)種特征也有差異,存在不同的突變位點(diǎn),如CHB中的I126S和HCC中的I126T。因此,準(zhǔn)種特征的差異表達(dá)對(duì)HBV感染轉(zhuǎn)歸有影響。

3 宿主遺傳基因的突變

既往CHB患者HBsAg和HBsAb共存的研究主要集中在HBV的因素上。然而,一些報(bào)道的病例存在HBsAg序列突變,但血清中沒(méi)有檢測(cè)到HBsAb[11];也有一些沒(méi)有HBsAg突變的病例同時(shí)存在HBsAg和HBsAb[4]。這表明HBV突變體可能不是慢性HBV患者發(fā)生HBsAg與HBsAb共存的唯一原因。為了探討HBsAg和HBsAb共存機(jī)制的其他因素,有研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了宿主因素方面的研究。

全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association studies,GWAS)可以用來(lái)探索遺傳基因變異與復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián),識(shí)別復(fù)雜疾病易感性與抗性相關(guān)基因位點(diǎn)。Wang等[12]用GWAS進(jìn)行兩階段試驗(yàn),第一階段全基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBsAb共存CHB患者的候選基因,第二階段進(jìn)行候選基因特定區(qū)域直接測(cè)序的驗(yàn)證試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBsAb共存CHB患者12號(hào)染色體存在寡聚核苷酸合成酶3(oligoadenylate synthetases 3,OAS3)基因的罕見(jiàn)變異。

為了進(jìn)一步揭示宿主其他相關(guān)基因與HBsAg和HBsAb共存是否有關(guān),Fan等[13]在前者第一階段試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)P值選擇30個(gè)與HBV相關(guān)肝病有關(guān)的候選基因,擴(kuò)大HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)組和HBsAg-和HBsAb+對(duì)照組的驗(yàn)證樣本數(shù),通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(time of flight mass spectrometry,TOF)確認(rèn)遺傳基因,發(fā)現(xiàn)位于9號(hào)染色體的胞質(zhì)分裂蛋白8(dedxcator of Gytokmesis 8,DOCK8)等位基因(rs506121-T)和碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9,CA9)等位基因(rs2071676-A)在HBsAg和HBsAb共存CHB患者中表達(dá)升高。以上研究均表明,宿主遺傳基因與CHB患者HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)的產(chǎn)生有一定的關(guān)系。

4 宿主免疫組庫(kù)(immune repertoire,IR)表達(dá)的差異

IR是T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)和B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)(也稱為免疫球蛋白,Ig)的總和,構(gòu)成機(jī)體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[14]。

TCR是T細(xì)胞特異性識(shí)別和結(jié)合抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu),大多數(shù)TCR由α和β肽鏈組成,少數(shù)T細(xì)胞的TCR由γ和δ肽鏈組成。每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V 區(qū))、恒定區(qū)(C 區(qū))、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分。而α和β 2條肽鏈的V 區(qū)(Vα、Vβ)又各有3個(gè)高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3,其中以CDR3變異最大,直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。TCR的CDR3由V、D、J 3個(gè)基因編碼,在淋巴細(xì)胞的成熟過(guò)程中,通過(guò)V、D、J 基因的隨機(jī)選擇和重組,連接區(qū)多樣性和α/β或γ/δ鏈配對(duì)形成了TCR的多樣性[15-17]。

BCR是一種Y型蛋白,由2條相同的大重鏈(IGH)和2條相同的小輕鏈κ(IGK)或λ(IGL)組成。重鏈可變區(qū)由V、D和J基因家族編碼,輕鏈可變區(qū)由V和J基因家族編碼[18]。在B細(xì)胞發(fā)育和成熟過(guò)程中,V(D)J基因片段的隨機(jī)重組是由幾個(gè)酶樣重組激活基因(RAG1/RAG2)介導(dǎo),V-D和D-J(輕鏈的V-J)連接區(qū)域的隨機(jī)插入或刪除有助于BCR的多樣性[19-20]?？乖碳ず?會(huì)引起體細(xì)胞的高頻突變,主要是在編碼V區(qū)CDR部位的基因序列發(fā)生堿基的點(diǎn)突變。除此之外,基因轉(zhuǎn)錄和重鏈/輕鏈配對(duì)也提高了BCR的多樣性[14]。

免疫組庫(kù)測(cè)序(immune repertoire sequencing,IRS)可以用來(lái)探索宿主免疫系統(tǒng)抵御HBV感染的遺傳反應(yīng)和免疫特征。常樂(lè)等[21]研究HBsAg和HBsAb共存CHB患者TCR β鏈CDR3免疫組庫(kù),發(fā)現(xiàn)V基因型TRBV5-8的表達(dá)低于HBsAg-和HBsAb+對(duì)照組,V基因型TRBV28低于HBsAg+和HBsAb-對(duì)照組;進(jìn)一步在克隆層面分析發(fā)現(xiàn),克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1在共存組的表達(dá)高于HBsAg-和HBsAb+對(duì)照組,而克隆型TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7的表達(dá)低于HBsAb-和HBsAb+對(duì)照組,說(shuō)明機(jī)體免疫系統(tǒng)表達(dá)的差異與HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)模式存在一定的關(guān)聯(lián)。

隨后,Zhan等[22]擴(kuò)大HBsAg+和HBsAb+雙陽(yáng)實(shí)驗(yàn)組和HBsAg-和HBsAb+以及HBsAg+和HBsAb-對(duì)照組入組標(biāo)本數(shù),分析HBsAg和HBsAb共存CHB患者的TCR β鏈和BCR免疫組庫(kù)表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)一些V、D和J基因型如IGHV3-64、IGHV3-75、TRBV5-4、TRBV12-5、TRAV14DV4、IGHD3-16、IGHD6-13和IGHJ3,對(duì)應(yīng)表達(dá)這些基因型的細(xì)胞,尤其是B淋巴細(xì)胞,在HBsAg和HBsAb共存患者中擴(kuò)展程度不同。用序列預(yù)測(cè)工具發(fā)現(xiàn)“CASSLG”基序在HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)患者實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量增加,“GAGPLT”基序只在HBsAg-和HBsAb+健康對(duì)照組出現(xiàn),其可能與HBsAb中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)。這些研究可能為HBV疫苗的研發(fā)和CHB的治療提供重要參考價(jià)值。

5 預(yù)后與管理

CHB患者HBsAg和HBsAb共存現(xiàn)象在臨床上越來(lái)越多見(jiàn),且這種雙陽(yáng)模式的CHB較易發(fā)展為進(jìn)展期肝病,如肝纖維化、肝硬化和HCC[23-24]。另外,這一情況增加了患者的治療難度,其治愈率也較低[25]。因此,臨床醫(yī)生遇到CHB患者血清中同時(shí)出現(xiàn)HBsAg和HBsAb時(shí),對(duì)這種雙陽(yáng)模式的患者要多關(guān)注并定期復(fù)查,并結(jié)合其他檢測(cè)指標(biāo)(如生物化學(xué)指標(biāo)、HBV DNA檢測(cè)和影像學(xué)檢查等)來(lái)評(píng)估和判斷患者的臨床狀態(tài),據(jù)此調(diào)整患者的治療方案。實(shí)驗(yàn)室工作人員發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBsAb檢測(cè)結(jié)果同時(shí)陽(yáng)性時(shí),應(yīng)進(jìn)行審核分析。首先要排除標(biāo)本和檢測(cè)程序的問(wèn)題,通過(guò)復(fù)測(cè)、留樣再測(cè)及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等過(guò)程,準(zhǔn)確發(fā)送檢驗(yàn)報(bào)告。在這個(gè)過(guò)程中,及時(shí)與臨床溝通?？傊?對(duì)于此類患者,要加強(qiáng)跟蹤隨訪,密切關(guān)注不良肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生。