多黏菌素與美羅培南聯(lián)合應(yīng)用對(duì)碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌多黏菌素異質(zhì)性耐藥的體外抗菌活性分析*

尉景娟,陳碩,孫偉,許穎,張婧雯,馬立艷

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,北京 100050)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, Kpn)是臨床常見致病菌,也是院內(nèi)感染的主要致病菌之一[1]。近年來,隨著抗菌藥物不合理使用的逐漸增加,多重耐藥及泛耐藥革蘭陰性桿菌導(dǎo)致的感染也不斷增加,成為威脅人類健康的主要原因之一。其中碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)引起的感染更是臨床抗感染治療中的棘手問題[2-3]。由CRKP引起的感染是導(dǎo)致有多種合并癥患者死亡的獨(dú)立因素[4-5]。面對(duì)CRKP日益嚴(yán)峻的耐藥形式,多黏菌素(polymyxin, POL)被重新考慮應(yīng)用于臨床抗感染治療,并認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭陰性菌引起感染的最后一道防線[6]。但是,隨著POL的廣泛使用,抗菌藥物的選擇壓力導(dǎo)致細(xì)菌從敏感變?yōu)槟退?使細(xì)菌避免被POL殺死[7]。由于在具有相同遺傳背景的細(xì)菌中,存在表現(xiàn)為對(duì)抗菌藥物有較高耐藥性的細(xì)菌亞群即異質(zhì)性耐藥菌株的存在,導(dǎo)致常規(guī)劑量的抗菌藥物治療失敗,使患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)間,并進(jìn)一步加劇抗菌藥物的耐藥性[8]。在實(shí)際臨床工作中,臨床醫(yī)生更傾向于用聯(lián)合治療來發(fā)揮抗菌藥物更好的抗菌效果。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CRKP中對(duì)POL的異質(zhì)性耐藥程度,并確定POL與美羅培南(meropenem, MEM)聯(lián)合應(yīng)用在體外對(duì)存在異質(zhì)性耐藥的CRKP的抗菌活性,為臨床聯(lián)合用藥抗感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集北京友誼醫(yī)院2021年1月至12月臨床分離的1 088株肺炎克雷伯菌,排除同一患者同一部位來源的重復(fù)菌株,經(jīng)篩選獲得肺炎克雷伯菌381株。所有菌株均由基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定為肺炎克雷伯菌。藥物敏感試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 13883,均購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器和試劑 質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司),Mueller-Hinton(M-H)肉湯及哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(英國Oxoid公司),POL(中國食品藥品檢定研究所),MEM(杭州默沙東制藥有限公司),八通道微量移液器(德國Eppendorf公司)。

1.3藥物敏感性試驗(yàn) 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)操作規(guī)程[9],采用微量肉湯稀釋法檢測POL及MEM的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。配制藥物母液濃度5 120 μg/mL,倍比稀釋為0.125～64 μg/mL的濃度梯度,依次取100 μL加入96孔板相應(yīng)位置。新鮮培養(yǎng)的待測菌株及質(zhì)控菌株配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪?用陽離子校正M-H肉湯稀釋20倍后加入96孔板,每孔加入10 μL,37 ℃溫育16～18 h后讀取MIC值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)歐洲抗微生物藥物敏感性委員會(huì)(EUCAST)10.0版的折點(diǎn)[10]判斷多黏菌素敏感性。

1.4群體譜分析(population analysis profiles, PAPs) 對(duì)POL MIC值0.25～2 μg/mL的CRKP進(jìn)行POL的異質(zhì)性耐藥菌株篩選。配制2.5～320 μg/mL的POL溶液,與高壓滅菌后的M-H瓊脂混勻配制成濃度為0.125～16 μg/mL POL的M-H瓊脂平板。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的CRKP調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?每個(gè)含藥平板上用滅菌三角棒將50 μL菌液涂布均勻,干燥后35 ℃培養(yǎng)48 h后對(duì)生長20～200 CFU/mL的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每株細(xì)菌重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取3次結(jié)果的均值。在POL濃度≥2 μg/mL的M-H瓊脂平板上有菌落生長,則判定該菌株為POL異質(zhì)性耐藥[11]。

1.5PCR擴(kuò)增篩選耐藥基因 篩選碳青霉烯酶編碼基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP及blaOXA-48,特異性引物根據(jù)GenBank中基因序列設(shè)計(jì)[12],引物序列見表1。采用吸附柱法提取細(xì)菌DNA,反應(yīng)體系包括:2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL,ddH2O 4.5 μL,上、下游引物各0.75 μL,模板1.5 μL,共15 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,32次循環(huán);再72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物由北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技公司測序并與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì),最終確認(rèn)CRKP的耐藥基因。

表1 CRKP耐藥基因引物序列

1.6時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn)(time-kill study) 選取3株攜帶不同耐藥基因的異質(zhì)性耐藥CRKP菌株進(jìn)行殺菌曲線試驗(yàn):blaKPC陽性BJFH54號(hào)菌株,blaNDM陽性BJFH67號(hào)菌株,blaKPC+blaNDM均陽性BJFH21號(hào)菌株。POL配制0.5MIC、1MIC濃度溶液,MEM配制0.25MIC、0.5MIC、1MIC濃度溶液,分別繪制每種藥物每種濃度的時(shí)間-殺菌曲線。將POL和MEM配制成POL 0.5MIC+MEM 0.25MIC、POL 0.5MIC+MEM 0.5MIC、POL 0.5MIC+MEM 1MIC、POL 1MIC+MEM 0.25MIC、POL 1MIC+MEM 0.5MIC、POL 1MIC+MEM 1MIC共6種聯(lián)合用藥方案,繪制聯(lián)合用藥的時(shí)間-殺菌曲線。挑取新鮮培養(yǎng)的單個(gè)菌落溶于10 mL CAMHB肉湯中,37 ℃用搖床搖至生長對(duì)數(shù)期,將菌液轉(zhuǎn)移至含有單藥或不同濃度聯(lián)合藥物的10 mL CAMHB肉湯中,調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?37 ℃搖床搖菌,分別在0、1、2、4、8、12、24、48 h取樣,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂于M-H平板上,將細(xì)菌終濃度1×106CFU/mL的M-H肉湯作為生長對(duì)照,37 ℃溫育24 h后計(jì)數(shù)菌落并繪制殺菌曲線。若培養(yǎng)24 h時(shí)的菌液濃度比初始菌液濃度減少≥3log10CFU/mL,則判斷其有殺菌活性[13]。

2 結(jié)果

2.1藥物敏感性 通過微量肉湯稀釋法對(duì)381株CRKP檢測POL及MEM的MIC值,根據(jù)CLSI M100推薦的MEM折點(diǎn)(MIC≤1 μg/mL為敏感,MIC≥4 μg/mL為耐藥)判斷,全部肺炎克雷伯菌MIC值均≥16 μg/mL,對(duì)MEM耐藥。根據(jù)EUCAST 10.0版推薦的POL折點(diǎn)(MIC≤2 μg/mL為敏感,MIC>2 μg/mL為耐藥)判斷,未發(fā)現(xiàn)對(duì)POL耐藥的菌株。

2.2PAPs 對(duì)POL MIC值在0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL及2 μg/mL的CRKP中,每個(gè)MIC值菌株中選取10株,共40株菌株進(jìn)行群體譜分析,其中存在對(duì)POL異質(zhì)性耐藥的菌株38株(占95%)。

2.3耐藥基因 對(duì)38株存在POL異質(zhì)性耐藥的CRKP進(jìn)行耐藥基因測序,比對(duì)結(jié)果顯示,blaKPC陽性35株,blaNDM陽性6株,blaKPC+blaNDM均陽性3株。未檢出blaVIM、blaIMP及blaOXA-48陽性菌株。

2.4時(shí)間-殺菌曲線 篩選3株異質(zhì)性耐藥CRKP菌株:blaKPC陽性BJFH54號(hào)菌株,blaNDM陽性BJFH67號(hào)菌株,blaKPC+blaNDM均陽性BJFH21號(hào)菌株進(jìn)行試驗(yàn)。單獨(dú)使用不同濃度POL及MEM對(duì)異質(zhì)性耐藥的CRKP時(shí)間-殺菌曲線如圖1中A1-C1所示,與生長對(duì)照對(duì)比,低濃度單藥會(huì)在細(xì)菌生長初期呈現(xiàn)下降趨勢,生長12 h后,所有菌株均重新生長并超過其最初接種菌量。當(dāng)單藥藥物濃度達(dá)到1 MIC濃度時(shí),細(xì)菌初期的生長呈現(xiàn)快速下降,甚至在短時(shí)間內(nèi)可達(dá)到殺菌效果,但生長12 h后細(xì)菌亦均出現(xiàn)重新生長現(xiàn)象。POL與MEM聯(lián)合用藥的情況下,所有組合的時(shí)間-殺菌曲線均呈現(xiàn)出協(xié)同作用,并能達(dá)到殺菌效果,如圖1中A2-C2、A3-C3所示。BJFH54號(hào)菌株及BJFH67號(hào)菌株在所有聯(lián)合用藥的情況下均可在作用2 h后達(dá)到殺菌效果,而攜帶雙耐藥基因的BJFH21號(hào)菌株也可在4 h后達(dá)到殺菌效果。

注:不同濃度多黏菌素及美羅培南單藥時(shí)間-殺菌曲線(A1-C1),0.5MIC多黏菌素與不同濃度美羅培南聯(lián)合應(yīng)用的時(shí)間-殺菌曲線(A2-C2),1MIC多黏菌素與不同濃度美羅培南聯(lián)合應(yīng)用的時(shí)間-殺菌曲線(A3-C3)。

3 討論

隨著世界范圍內(nèi)抗菌藥物的濫用,細(xì)菌耐藥性不斷增加,極大地增加了院內(nèi)感染的治療難度,而CRKP是其中重要的致病菌之一[14]。POL于20世紀(jì)40年代末開始被廣泛使用,后因其高腎毒性而被限制[15]。由于多重耐藥細(xì)菌比例日漸增高,POL對(duì)多重耐藥菌表現(xiàn)出的強(qiáng)殺菌作用,使其成為目前最有效的抗感染藥物之一,成為治療CRKP的最后一道防線[16]。

異質(zhì)性耐藥是細(xì)菌耐藥進(jìn)化進(jìn)程中的一種特殊形式,是在具有相同遺傳背景的細(xì)菌中,存在表現(xiàn)對(duì)抗菌藥物有較高的耐藥性的細(xì)菌亞群[17]。實(shí)際臨床工作中的常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測不到異質(zhì)性耐藥亞群菌株,需要采用PAPs進(jìn)行檢測[18]。本研究對(duì)381株CRKP進(jìn)行了POL體外藥敏試驗(yàn),其敏感率高達(dá)100%。選取對(duì)POL不同MIC值的CRKP經(jīng)過PAPs篩選后,發(fā)現(xiàn)對(duì)POL異質(zhì)性耐藥率高達(dá)95%,稍低于Tian等[19]的研究數(shù)據(jù)。研究顯示,單獨(dú)使用POL或MEM對(duì)異質(zhì)性耐藥菌株的體外效果不理想,即使在高濃度POL作用下早期出現(xiàn)殺菌效果,也會(huì)在培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)細(xì)菌的重新生長,導(dǎo)致治療失敗[20]。說明POL治療CRKP感染存在非常高的耐藥風(fēng)險(xiǎn),其異質(zhì)性耐藥的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致臨床治療更為棘手,因此尋求合理用藥方式,加強(qiáng)聯(lián)合用藥,避免POL作為抗感染最后一道防線治療的失敗。

聯(lián)合用藥能夠縮短治療周期,增加抗菌藥物活性,是避免異質(zhì)性耐藥高發(fā)的一種有效手段[21]。目前尚少見聯(lián)合用藥治療對(duì)多黏菌素異質(zhì)性耐藥CRKP的效果研究,本試驗(yàn)選取目前臨床上常用抗菌藥物之一的MEM,與POL聯(lián)合用藥是臨床常用的抗菌藥物組合,探討聯(lián)合用藥對(duì)POL異質(zhì)性耐藥CRKP的體外抗菌效果。通過時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn),相較于POL單獨(dú)使用及MEM單獨(dú)使用時(shí)的菌株生長只能被短時(shí)抑制,而在12 h后重新大量增殖的情況,POL聯(lián)合MEM使用可使BJFH54(blaKPC陽性)、BJFH67(blaNDM陽性)在低濃度下(POL 0.5MIC+MEM 0.25MIC)作用2 h后達(dá)到殺菌效果,BJFH21(blaKPC+blaNDM均陽性)在低濃度下也可在4 h后達(dá)到殺菌效果,且殺菌效果可持續(xù)48 h,說明低濃度的POL與MEM聯(lián)合應(yīng)用即可對(duì)CRKP有很好的殺菌效果。其機(jī)制可能是POL破壞細(xì)菌細(xì)胞膜后增加MEM的殺菌效果,而MEM對(duì)blaVIM、blaIMP及blaOXA-48陽性菌株均有很好的體外殺菌效果。Soudeiha等[22]聯(lián)合應(yīng)用POL及MEM對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2種藥物的聯(lián)合使用可使其MIC值較單獨(dú)使用2種藥物的MIC值下降2.6倍,具有很好的協(xié)同效果,與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

POL與MEM的聯(lián)合用藥在保證清除異質(zhì)性耐藥菌株的基礎(chǔ)上,減少了單藥的藥物使用濃度,亦減少多黏菌素在高濃度下副作用的發(fā)生,為臨床治療提供了以POL為基礎(chǔ),聯(lián)合美羅培南治療CRKP的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。盡管在本實(shí)驗(yàn)中,POL與MEM的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)異質(zhì)性耐藥的CRKP表現(xiàn)出很好的殺菌效果,但是時(shí)間-殺菌曲線檢測的是體外藥敏效果,并不能準(zhǔn)確反映人體內(nèi)的抗菌活性,而且受限于試驗(yàn)菌株數(shù)量過少及認(rèn)知水平的局限,對(duì)于聯(lián)合用藥治療CRKP對(duì)POL異質(zhì)性耐藥方案需進(jìn)一步深入研究,使其聯(lián)合用藥方案切實(shí)可行,成為治療優(yōu)選。