5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑應(yīng)用于DXcellenceTM全自動核酸檢測分析系統(tǒng)的性能評估*

軒乾坤,吳文娟

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院檢驗(yàn)科,上海200123)

核酸檢測在新型冠狀病毒感染的預(yù)防、診斷和治療過程中扮演了重要角色[1-3]。隨著新型冠狀病毒肺炎在我國歸于“乙類乙管”[4],其核酸檢測調(diào)整為“愿檢盡檢”,不再開展全員核酸篩查[5],市場開始對中低通量、靈活、快速的一體化全自動核酸檢測設(shè)備產(chǎn)生需求。本研究使用的封閉式一體化PCR檢測系統(tǒng)DXcellenceTM[6],在實(shí)現(xiàn)“核酸提取—擴(kuò)增—檢測”整合一體化的同時(shí),還兼具操作簡易、快速、密閉的特點(diǎn),適用于急診、兒科、發(fā)熱門診等小型實(shí)驗(yàn)室,同時(shí)能保證高特異性和敏感性,可實(shí)現(xiàn)樣本進(jìn)結(jié)果出的快速檢測。

該DXcellenceTM核酸檢測系統(tǒng)一般檢測單采樣本,需要人工對采樣管開蓋,可原管上機(jī)檢測,兼容多種型號的采樣管,可以在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行自動加樣、磁珠法核酸提取、機(jī)械臂點(diǎn)樣、q-PCR擴(kuò)增及信號采集、判讀,最后系統(tǒng)自動生成檢測報(bào)告。該系統(tǒng)由控制部件、熱蓋部件、熱循環(huán)部件、光電部件、傳動部件、電源部件、外殼及嵌入式軟件組成,基于磁珠法的核酸提取和經(jīng)典的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測原理,可對樣本中的靶核酸(DNA/RNA)進(jìn)行高質(zhì)量提取及定性、定量檢測。該系統(tǒng)包含12個(gè)獨(dú)立的溫控模塊,可實(shí)現(xiàn)多樣本不同擴(kuò)增程序的同時(shí)檢測,在新型冠狀病毒疑似陽性樣本復(fù)檢時(shí),能很好地滿足雙試劑快速檢測的需求。鑒于其全自動、操作方便、節(jié)省時(shí)間,并具有多重防污染設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn),本研究選取5種不同反應(yīng)條件的新型冠狀病毒核酸檢測試劑,在DXcellenceTM系統(tǒng)上進(jìn)行程序適配后,測試其最低檢出限、精密度、符合率,以及艾科諾公司的核酸提取純化試劑盒與碩世病毒核酸提取試劑盒、凱杰公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取性能的比對,為臨床實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒全自動核酸檢測提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1陽性標(biāo)本 收集2022年4月29日在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院新型冠狀病毒核酸檢測為陽性的剩余咽拭子標(biāo)本10例,于-80 ℃保存待測。

1.1.2陰性標(biāo)本 收集2022年7月7日在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院新型冠狀病毒核酸檢測為陰性的剩余咽拭子標(biāo)本10例,于-80 ℃保存待測。

1.1.3采樣管 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)的一次性使用病毒采樣管,批號0822220301。

1.1.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) NIM-RM5207購自中國計(jì)量科學(xué)研究院,為新型冠狀病毒全序列假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),批次2103;包含已公布的新型冠狀病毒的4個(gè)主要基因,其標(biāo)準(zhǔn)值分別為:核衣殼蛋白N基因(28 274～29 533)84 copies/μL、E基因(26 245～26 472)77 copies/μL、S基因(21 563～25 384)164 copies/μL、ORF基因(18 040～21 552)132 copies/μL、ORF基因(13 025～18 039)116 copies/μL、ORF基因(8 555～13 024)121 copies/μL、ORF基因(2 720～8 554)106 copies/μL和ORF基因(266～2 719)145 copies/μL。由于標(biāo)準(zhǔn)品在ORF1ab的不同區(qū)段拷貝數(shù)定值不同,不能確定試劑檢測具體靶標(biāo)區(qū)段,故本文涉及新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品ORF1ab的拷貝數(shù)均計(jì)算為涵蓋各靶標(biāo)區(qū)段的范圍。

1.1.5核酸提取試劑 嘉興艾科諾公司生產(chǎn)的核酸提取純化試劑盒,批號20220301;江蘇碩世公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試劑盒,批號T202210216;凱杰公司生產(chǎn)的QIAamp Viral RNA Mini Kit,批號169039436。

1.1.6核酸提取儀 碩世全自動核酸提取儀SSNP-9600A(江蘇碩世公司)。

1.1.7新型冠狀病毒核酸檢測試劑 金迪安?新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,批號22010806,杭州迪安公司,本文中稱JDA);新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,批號220122,武漢明德公司,本文中簡稱MD);新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,批號20220545,江蘇碩世公司,本文中簡稱SS);新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,批號20220608142,北京金豪公司,本文中簡稱JH);新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,批號QP07220542,上海思路迪公司,本文中簡稱SLD)。

1.1.8檢測儀器 全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96S(上海宏石公司);DXcellenceTM全自動核酸檢測分析系統(tǒng)(嘉興艾科諾公司)。

1.2方法

1.2.1反應(yīng)體系及參數(shù) 5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的反應(yīng)體系(加樣量/總體積)、擴(kuò)增條件、循環(huán)數(shù)、結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)均按照各試劑盒說明書中標(biāo)示的信息,在DXcellenceTM全自動核酸檢測分析系統(tǒng)中進(jìn)行設(shè)置和操作。見表1。

表1 5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑基本信息

1.2.2核酸提取性能比對 采用碩世新型冠狀病毒核酸檢測試劑說明書推薦的碩世病毒核酸提取試劑盒和凱杰公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、艾科諾公司的核酸提取純化試劑盒分別對2份梯度稀釋的新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NIM-RM5207、10例新型冠狀病毒陽性樣本、10例新型冠狀病毒陰性樣本進(jìn)行核酸提取,使用碩世新型冠狀病毒核酸檢測試劑分別在宏石全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96S上進(jìn)行熒光PCR檢測,分析陰、陽性符合率和ORF1ab 基因循環(huán)閾值(Ct)在3種提取試劑間的相關(guān)性。

1.2.3檢出限(LoD) 用一次性使用病毒采樣管中的保存液將新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NIM-RM5207分別稀釋對應(yīng)倍數(shù)至略低于每種試劑盒說明書標(biāo)注的LoD,使用5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒分別對稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行20次檢測,統(tǒng)計(jì)各檢測試劑對ORF1ab基因和N基因的Ct值分布及檢出率。本實(shí)驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至ORF1ab 329～450 copies/mL,N基因260 copies/mL,在DXcellenceTM上進(jìn)行JDA、MD、JH試劑的測試;將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至ORF1ab 256～350 copies/mL,N基因203 copies/mL,進(jìn)行SS試劑的測試;將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至ORF1ab 146～200 copies/mL,N基因116 copies/mL,進(jìn)行SLD試劑的測試。

1.2.4精密度 用一次性使用病毒采樣管中的保存液將新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NIM-RM5207稀釋至ORF1ab 1 100～1 500 copies/mL,N基因869 copies/mL,作為弱陽性樣本;陰性樣本為已檢測新型冠狀病毒為陰性的剩余標(biāo)本。使用5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒分別對陰性和弱陽性樣本進(jìn)行檢測,每天檢測3次,連續(xù)檢測3 d,分別統(tǒng)計(jì)各檢測試劑檢測結(jié)果的陰陽性符合率,并計(jì)算陽性樣本的ORF1ab基因和N基因的Ct值均值和變異系數(shù)(coefficient of variation,CV),分析5種檢測試劑的精密度。

1.2.5符合率 在DXcellenceTM檢測系統(tǒng)上,用5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑分別測試已經(jīng)確認(rèn)的10例新型冠狀病毒陰性咽拭子樣本和10例新型冠狀病毒陽性咽拭子樣本;同時(shí)在經(jīng)驗(yàn)證的宏石全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)上,使用江蘇碩世公司新型冠狀病毒核酸檢測試劑測試上述10例新型冠狀病毒陰性咽拭子樣本和10例新型冠狀病毒陽性咽拭子樣本。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 26軟件。各基因?qū)?yīng)測試Ct值為計(jì)量資料,進(jìn)行相關(guān)系數(shù)(R)的統(tǒng)計(jì);根據(jù)Ct值和各自說明書進(jìn)行陰陽性判定,為等級資料,進(jìn)行符合率的統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.15種新型冠狀病毒核酸檢測試劑信息分析 本次研究選取的5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒均采用RT-qPCR方法檢測病毒的RNA。JDA、MD、JH、SS均采用人內(nèi)源性基因作為試劑盒的檢測內(nèi)標(biāo),而SLD采用外源性內(nèi)標(biāo),5種試劑均以新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因作為檢測靶標(biāo),3個(gè)靶標(biāo)在熒光通道的分配上有所不同。反應(yīng)程序方面,5種試劑均在逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)變性后分別進(jìn)行40～45個(gè)循環(huán)。SLD的反應(yīng)程序與其他四者不同,在每一個(gè)反應(yīng)階段均壓縮了大量的反應(yīng)時(shí)間,加快了反應(yīng)速度。見表1。

2.2核酸提取性能比對 由碩世病毒核酸提取試劑盒、凱杰公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、艾科諾公司的核酸提取純化試劑盒提取后的核酸,經(jīng)宏石全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96S進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,3種核酸提取試劑檢測的陰性符合率、陽性符合率、總符合率完全一致,均為100%;其ORF1ab 基因Ct值的相關(guān)系數(shù)分別為艾科諾提取(ACNM)與碩世提取(SS)為0.998,艾科諾提取(ACNM)與凱杰提取(QIAmp)為0.958,碩世核酸檢測試劑盒中推薦的2種核酸提取試劑盒SS與QIAmp為0.938。

2.3檢出限測試 5種檢測試劑對新型冠狀病毒靶基因檢測結(jié)果(Ct值)分布見圖1,根據(jù)說明書的判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷各基因檢測的陰陽性結(jié)果并計(jì)算檢出率,結(jié)果見表2。5種檢測試劑在檢出限濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測Ct值分布分別為JDA ORF1ab 34.26～37.96,N基因35.65～39.40;MD ORF1ab 34.31～37.74,N基因34.41～37.13;JH ORF1ab 33.81～36.37,N基因33.73～37.79;SS ORF1ab 34.1～36.12,N基因34.33～36.62;SLD ORF1ab 35.78～38.55,N基因33.93～36.12。5種檢測試劑在本次LoD樣本測試中的檢出率均為ORF1ab 100%(20/20),N基因100%(20/20)。

注:A,5種檢測試劑對各自LoD濃度的ORF1ab基因檢測Ct值分布;B,5種檢測試劑對各自LoD濃度的N基因檢測Ct值分布。

表2 5種試劑盒檢出限檢測結(jié)果

2.4精密度測試 與Accunome核酸提取純化試劑及DXcellenceTM系統(tǒng)配合,5種試劑的ORF1ab基因的檢測Ct值均值在31.91～33.74之間,其CV均在1.6%以內(nèi);而N基因的檢測檢測Ct值均值在32.62～35.57之間,其CV均在2%以內(nèi),表現(xiàn)出良好的精密度。同時(shí),5種試劑對陰性樣本進(jìn)行3 d,每天3次,共9次測試,其結(jié)果均為陰性。本部分測試陰陽性符合率、總符合率均為100%。見表3。

表3 5種新型冠狀病毒核酸檢測精密度測試

2.5符合率測試 對20例已確認(rèn)樣本進(jìn)行檢測,5種試劑在DXcellenceTM系統(tǒng)上檢測結(jié)果均為100%(10/10)陽性和100%(10/10)陰性,SS試劑在宏石全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)上檢測結(jié)果是100%(10/10)陽性和100%(10/10)陰性,陰、陽性符合率均為100%。其中10例陽性樣本的ORF1ab及N基因的Ct值分布見圖2。比較SS試劑在DXcellenceTM系統(tǒng)(圖2 SS/DXcellenceTM)及宏石熒光PCR系統(tǒng)上的Ct值(圖2 SS/SLAN),其分布相當(dāng),具有可比性。

注:A,5種檢測試劑在DXcellenceTM系統(tǒng)上對10例陽性樣本ORF1ab基因檢測Ct值分布,及SS試劑在宏石熒光PCR系統(tǒng)(SLAN)上對10例陽性樣本ORF1ab基因檢測Ct值分布;B,5種檢測試劑在DXcellenceTM系統(tǒng)上對10例陽性樣本N基因檢測Ct值分布,以及SS試劑在宏石熒光PCR系統(tǒng)(SLAN)上對10例陽性樣本N基因檢測Ct值分布。

3 討論

在本研究中,國家假病毒標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、分裝和陰陽性樣本的相關(guān)操作均按照要求在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,同時(shí)采用生物安全三級實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)[7],樣本準(zhǔn)備均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。由于DXcellenceTM全自動核酸檢測分析系統(tǒng)集加樣、核酸提取、PCR擴(kuò)增及檢測為一體,故本研究均在PCR實(shí)驗(yàn)室二區(qū)完成全部操作和檢測,為沒有條件建立標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室三區(qū)分布的情況進(jìn)行了探索和實(shí)踐。

本研究主要考察每種檢測試劑在DXcellenceTM系統(tǒng)上是否可以滿足其說明書聲稱的主要性能,而選取的5種新型冠狀病毒檢測試劑中,JDA、MD、JH 3種試劑聲稱的檢出限接近,故使用略低于該3種試劑聲稱的檢出限的標(biāo)準(zhǔn)品對其進(jìn)行驗(yàn)證。而SS和SLD的試劑聲稱檢出限更低,故使用更低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對其進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí),本次研究中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來自中國計(jì)量科學(xué)研究院,其ORF1ab基因濃度在不同序列區(qū)段有不同定值,由于不確定5種新型冠狀病毒檢測試劑的靶標(biāo)具體位置,故在ORF1ab基因的檢測中,標(biāo)注為不同區(qū)段的定值范圍,而測試使用的濃度不超過最高標(biāo)注濃度。

為應(yīng)對在新型冠狀病毒肺炎防控中對核酸檢測試劑更高靈敏度和更快速檢測的需求,國內(nèi)各廠家紛紛推出了更加快速的新型冠狀病毒核酸檢測試劑。本次研究特別選擇了SLD的核酸檢測試劑作為快速新型冠狀病毒檢測試劑的代表進(jìn)行了研究。由于各檢測平臺在升降溫速度、熒光掃描速度、數(shù)據(jù)處理速度方面均有所不同,本次研究使用DXcellenceTM分析系統(tǒng)與SLD快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑聯(lián)合使用,達(dá)到從提取到出具報(bào)告單樣本54 min,12個(gè)樣本共65 min的結(jié)果,為快速、高效、準(zhǔn)確的新型冠狀病毒核酸檢測提供了新的檢測方法。同時(shí),通過對5種新型冠狀病毒核酸檢測試劑在DXcellenceTM全自動核酸檢測分析系統(tǒng)“樣本進(jìn)、結(jié)果出”的無人值守式測試,也為臨床新型冠狀病毒核酸檢測提供一種減少人員操作步驟的便捷、準(zhǔn)確的檢測方法。

為了滿足快速檢測的需要,現(xiàn)有的大多能夠進(jìn)行快速新型冠狀病毒核酸檢測設(shè)備均使用了與經(jīng)典熒光定量PCR不同的方法學(xué),如等溫?cái)U(kuò)增等,故只能提供陰陽性檢測結(jié)果,不能報(bào)告Ct值。而DXcellenceTM檢測系統(tǒng)在檢測方法學(xué)上采用了經(jīng)典的熒光定量PCR法,其Ct值與常規(guī)熒光定量PCR檢測平臺具有可比性。DXcellenceTM檢測系統(tǒng)包含12個(gè)獨(dú)立的溫控模塊,在同一輪測試內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不同樣本不同擴(kuò)增程序的熒光PCR擴(kuò)增,故可同時(shí)進(jìn)行雙試劑快速自動化檢測,能很好地適用于新型冠狀病毒疑似陽性樣本的復(fù)檢,且滿足臨床上需要報(bào)告Ct值的要求。