廣西邊境地區(qū)與非邊境地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)分析

葉婧，周崇興，林玫，先曉敏，梁小煙，張影坤，藍(lán)如束，崔哲哲

1.廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西重大傳染病防控與生物安全應(yīng)急響應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西結(jié)核病防治重點(diǎn)學(xué)科平臺(tái)，廣西 南寧 530028；2.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；3.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，2021 年全球新增結(jié)核病患者約1060 萬例，死亡160 萬例[1]，在包括我國在內(nèi)的大部分國家或地區(qū)，結(jié)核病仍然是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題[2-3]。廣西地處我國西南部，由于經(jīng)濟(jì)相對落后、人群居住密集、醫(yī)療資源有限，結(jié)核病的發(fā)生率處于全國較高水平[4]。同時(shí)，因與越南接壤，廣西結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）外來譜系輸入的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。全基因組測序技術(shù)（whole-genome sequencing，WGS）是近年來廣泛應(yīng)用于MTB 分子生物學(xué)研究的一項(xiàng)技術(shù)[5-6]，為了解廣西邊境與非邊境地區(qū)MTB 基因型的分布特征及流行情況，本研究使用WGS 技術(shù)對來自廣西邊境與非邊境地區(qū)的MTB菌株進(jìn)行了基因組學(xué)分析，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 選取廣西境內(nèi)東、西、南、北、中5個(gè)方位的桂林、貴港、崇左、百色和防城港5 個(gè)市作為調(diào)查點(diǎn)。其中，與越南接壤的百色、崇左、防城港3 個(gè)市作為邊境組，未與越南接壤的桂林、貴港2 個(gè)市作為非邊境組。收集2015—2017 年當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病患者的痰液，采用固體中性羅氏培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)室進(jìn)行MTB 的分離培養(yǎng)。

1.2 檢測方法

1.2.1 DNA 提取 采用CTAB 法提取DNA[7]，在1.5 mL 離心管加入400 μL 1× TE 緩沖液并取滿環(huán)生長良好的結(jié)核分枝桿菌，置于80℃水浴30 min滅活，將滅活后的菌液在細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀超聲1 min，使細(xì)菌充分分散，再加入溶菌酶使細(xì)菌充分破壁，然后用SDS/蛋白酶K 混合，用CTAB/NaCl 溶液沉淀非核酸細(xì)胞碎片，用氯仿/異戊醇提取DNA，沉淀物經(jīng)洗滌且自然干燥后，加入50 μL 1×TE 緩沖液使其充分溶解，置-20℃保存?zhèn)溆茫鳛閃GS 檢測的DNA 模板。

1.2.2 全基因組測序分析 由北京諾禾致源生物有限公司進(jìn)行檢測，利用高通量二代Illumina 測序技術(shù)平臺(tái)，進(jìn)行DNA 片段文庫構(gòu)建，雙端測序，PE150，深度至少200×，每個(gè)樣品總測序深度數(shù)據(jù)量≥1G clean data。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾處理，去除包含A-dapter 的序列及低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到的Clean Da‐ta 用于后續(xù)分析。以H37Rv 菌株的全基因組序列（NC000962.2）作為參考模板，使用Samtools 軟件進(jìn)行比對獲得每株菌株單核苷酸多態(tài)性（single nu‐cleotide polymorphism，SNP）[8]。 將SNP 數(shù) 據(jù) 與H37Rv 進(jìn)行比對，獲得每株菌株的基因型[9]。采用SAM-TB 平臺(tái)根據(jù)SNP 的數(shù)據(jù)鑒定MTB 菌株的譜系[10]。將SNP 數(shù)據(jù)與已報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對[11]，獲得每株菌株對一線抗結(jié)核藥品耐藥突變基因的類型。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，組間計(jì)數(shù)資料差異的比較采用χ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)或Fish‐er 確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 MTB 菌株全基因組測序分型結(jié)果 共有646株MTB 菌株納入本次研究。測序結(jié)果顯示，MTB菌株主要分為4 個(gè)譜系，包括Lineage 1（簡稱L1）、Lineage 2（簡稱L2）、Lineage 3（簡稱L3）和Lineage 4（簡稱L4）。從不同年份看，三年間四種譜系分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。邊境組測序分析了199 株，結(jié)果顯示L2（126/199，63.32%）和L4（64/199，32.16%）是主要流行譜系，L1 占4.02%（8/199），L3 僅發(fā)現(xiàn)1 株；非邊境組測序分析了447株，L2（299/447，66.89%）和L4（144/447，32.21%）是主要流行譜系，L1 占0.89%（4/447），L3 未發(fā)現(xiàn)。邊境組與非邊境組基因型構(gòu)成分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.754，P＜0.05）。見表2。

表1 MTB 菌株譜系時(shí)間分布［n（%）］Table 1 Time distribution of MTB strain lineage［n（%）］

表2 廣西邊境組和非邊境組MTB 菌株譜系構(gòu)成（例）Table 2 The Lineages of 646 MTB strains in border and non border groups in Guangxi（n）

作為最主要的流行譜系，L2 可分為亞譜系L2.1、L2.2 和L2.3，邊境和非邊境組均以亞譜系L2.3 為主。L2 及其各亞譜系在邊境與非邊境組的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.781、0.219、0.419、0.005，P均＞0.05）。L4 在本研究中共發(fā)現(xiàn)7 個(gè)亞譜系，分別為L4.1.2、L4.2～L4.5、L4.7 和L4.9，邊境和非邊境組以亞譜系L4.2、L4.4 和L4.5 為主。L4.4 和L4.5 亞譜系在邊境和非邊境組的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.779、0.029，P均＞0.05）。L4.2 亞譜系和L1 譜系在邊境組與非邊境組的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.833、5.763，P均＜0.05）。見表3。

表3 邊境組和非邊境組MTB 菌株基因型分布［n（%）］Table 3 Genotype distribution of MTB strains in border and non border groups in Guangxi［n（%）］

2.2 MTB 菌株耐藥基因突變類型及分布情況WGS 結(jié)果分析，196 株MTB 菌株發(fā)生了5 種抗結(jié)核藥物的相關(guān)耐藥基因突變，突變率為30.34%（196/646）。其中邊境組為40.70%（81/199），非邊境組為25.73%（115/447），邊境組的耐藥基因突變率高于非邊境組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.613，P＜0.05）。

對196 株菌株分別進(jìn)行5 種藥物的耐藥突變基因分析得出，突變率最高的是katG（15.94%，103/646），其 次 分 別 是ropB（11.30%，73/646）、embB（6.04%，39/646）、rpsL（5.88%，38/646）和rrsL（3.72%，24/646）。對突變率前5 的耐藥相關(guān)基因的分布分析發(fā)現(xiàn)，katG、ropB、rpsL 基因在邊境組的突變率均高于非邊境組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.716、9.603、6.979，P均＜0.05）。見表4。對突變率前5 的耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)的分布分析發(fā)現(xiàn)，katG315、rpoB450、rpsL43 基因位點(diǎn)在邊境組與非邊境組的分 布 差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=5.153、12.893、11.693，P均＜0.05）。見表5。

表4 MTB 分離株耐藥基因突變在廣西邊境與非邊境地區(qū)的分布［n（%）］Table 4 Distribution of drug resistance gene mutations in MTB isolates in border and non-border areas in Guangxi［n（%）］

表5 MTB 分離株耐藥基因突變位點(diǎn)在廣西邊境與非邊境地區(qū)的分布Table 5 Distribution of drug resistance gene point-mutations in MTB isolates in border and non-border areas in Guangxi

3 討 論

基于WGS 的單個(gè)核酸多態(tài)性（SNP）是MTB常用的基因分型方法，該方法具有通量大、分辨率高、可進(jìn)行精準(zhǔn)分型和鑒定、能夠構(gòu)建完整的DNA序列等優(yōu)點(diǎn)[12]，既往研究表明，其與McSpoligotyp‐ing 分型方法的一致性可達(dá)94.18%[7]。目前，WGS在MTB 分離株基因分型方面具有許多優(yōu)勢，并且可以有效地研究MTB 分離株的傳播動(dòng)力學(xué)，可鑒定出與MTB 耐藥相關(guān)的基因突變[13]。

研究表明[14-15]，MTB 基因分型可以分為7 個(gè)主要譜系（Lineage 1～7，簡稱L1～L7），本研究發(fā)現(xiàn)廣西主要流行譜系為L2 和L4，這與我國總體情況基本一致[16]。廣西的邊境和非邊境地區(qū)的L2 譜系均以亞譜系L2.3 為主，L4 譜系均以亞譜系L4.2、L4.4 和L4.5 為主。既往研究認(rèn)為，L4.5 亞譜系主要存在于中國，且可能由廣東向西南傳播[17-18]，本次研究結(jié)果一定程度上佐證了上述觀點(diǎn)。L1 和L3 譜系主要流行于東非、中亞、南亞及東南亞等地[19-20]，但在我國較為少見，本研究在廣西邊境和非邊境地區(qū)均發(fā)現(xiàn)L1 譜系，且在邊境地區(qū)發(fā)現(xiàn)1 例L3 譜系，推測可能是從東南亞地區(qū)經(jīng)邊境傳入，并有繼續(xù)向非邊境地區(qū)傳播的可能。

既往研究表明，廣西的結(jié)核病耐藥負(fù)擔(dān)較重[21]。MTB 耐藥的主要機(jī)制是基因突變，廣西邊境地區(qū)耐藥基因突變率高于非邊境地區(qū)，與越南河內(nèi)的突變率較為接近[22]，可能因?yàn)檫吘车貐^(qū)人口構(gòu)成較為復(fù)雜，人口流動(dòng)較大且與鄰國經(jīng)濟(jì)文化交流較為頻繁。

既往研究中，與異煙肼（isoniazid，INH）耐藥相關(guān)的基因主要有katG 和inhA[23]。本研究中，在耐INH 基因突變菌株中共檢測4 種基因發(fā)生突變，分別為katG、fabG1、ahpC 和inhA，INH 的耐藥基因突變率在主要抗癆藥物中最高（19.20%），與青海省和杭州市的報(bào)道基本一致[24-25]。4 種基因突變中以katG 基因突變?yōu)橹?，主要突變位點(diǎn)為katG315，與Sunil 等[26]研究一致；此外哈薩克斯坦、伊朗和我國北京市[27-29]的研究數(shù)據(jù)也都提示katG315 位點(diǎn)突變比例高。該現(xiàn)象可能與INH 作為全效抗結(jié)核藥物被廣泛用于結(jié)核治療有關(guān)[30]，當(dāng)患者不規(guī)律用藥，治療依從性差時(shí)，便容易產(chǎn)生INH 的耐藥，應(yīng)當(dāng)引起重視。

利福平（rifampin，RIF）是重要的一線抗結(jié)核藥物，用于治療結(jié)核已超過50 年[31]。本研究發(fā)現(xiàn)MTB 分離株耐RIF 基因突變（11.30%）僅次于耐INH。利福平耐藥主要是rpoB 基因突變導(dǎo)致，本研究中廣西rpoB 基因突變位點(diǎn)以rpoB450 和rpoB445 為主，與曾美春等[32]報(bào)道的浙江rpoB 最常見的突變位點(diǎn)是rpoB450 較為一致。我國不同地區(qū)rpoB 基因突變位點(diǎn)呈多樣化，但本研究中400、427、430、431、432、435、437 和452 等突變位點(diǎn)均有發(fā)現(xiàn)，可能與研究的地區(qū)及民族的差異性有關(guān)，側(cè)面說明耐藥基因突變特征在不同民族中可能存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，邊境組katG、ropB 和rpsL 基因的突變率高于非邊境組，可能與邊境地區(qū)結(jié)核病控制水平、結(jié)核病治療人群的相關(guān)求醫(yī)行為以及當(dāng)?shù)鼐甑倪z傳背景等有關(guān)，具體原因尚待進(jìn)一步研究。

不同國家、不同省份、甚至同個(gè)省份不同城市的結(jié)核病耐藥率及耐藥基因突變譜都可能不同。目前我國仍然缺乏對這些耐藥基因突變位點(diǎn)分布的總體描述。本研究在基因組學(xué)的水平上分析了主要的耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)和頻率，給全國耐藥相關(guān)基因突變的分布提供了一部分依據(jù)。在今后的工作中，應(yīng)加強(qiáng)結(jié)核病的耐藥篩查，盡早發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病患者，通過指導(dǎo)臨床規(guī)范治療、加強(qiáng)管理，降低耐藥結(jié)核病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

利益沖突聲明全部作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明葉婧、周崇興、崔哲哲負(fù)責(zé)撰寫和修改論文；林玫負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)研究思路；藍(lán)如束、梁小煙、先曉敏、張影坤負(fù)責(zé)研究數(shù)據(jù)的獲取和分析