重樓皂苷Ⅰ對去勢抵抗性前列腺癌DU145細胞增殖及凋亡的影響

鄒佩良 鄒嘉茹 蔡家麗 何啟雄 周建甫 向松濤

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是全球常見惡性腫瘤之一,在男性中的發(fā)病率僅次于肺癌[1]。多數(shù)晚期PCa患者經(jīng)雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy, ADT)1～2年后便會產(chǎn)生耐受并逐漸演變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?castration-resistant prostate cancer, CRPC)[2]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)多種中藥單體具有良好的抗腫瘤作用,其中,重樓皂苷Ⅰ(polyphyllin Ⅰ, PPⅠ)為重樓中最主要的活性成分,可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞周期阻滯、促進腫瘤細胞的凋亡和自噬以及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、提高化療敏感性和調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境等途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用[3-4],但其對CRPC的作用及機制研究尚少。因此,本文在已有研究的基礎上[5],繼續(xù)探討PPⅠ對CRPC DU145細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制。

材料與方法

一、試劑來源及細胞培養(yǎng)

PPⅠ購自成都曼徹斯特公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰酶和磷酸鹽緩沖液均購自美國Gibco公司;MTT粉和DMSO均購自廣州威佳科技有限公司;細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和蛋白上樣緩沖液均購自碧云天生物公司;一抗p-ERK1/2、ERK1/2、特異性蛋白1(specificity protein 1, SP1)、Zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)及羊抗兔二抗均購自CST公司;SP1、EZH2過表達質(zhì)粒(pcMV6-SP1、pcMV6-EZH2)和EZH2啟動子質(zhì)粒(p-EZX-PG04-EZH2)均由廣東省中醫(yī)院韓守威教授團隊提供。人CRPC DU145細胞株由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院科研實驗中心提供。將細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱。

二、MTT檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期細胞,以3×103/孔的細胞密度接種于96孔板,待細胞貼壁后,加入不同濃度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1)溶液100 μl,分別培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入濃度0.5 g·L-1的MTT溶液110 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入DMSO 150 μl,在570 nm波長處測定每孔吸光值(A值),設空白組細胞存活率為100%,細胞存活率(%)=(加藥組A值/空白組A值)×100%。

三、流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取對數(shù)生長期細胞,以3×105/孔的細胞密度接種于6孔板,待細胞貼壁后加入不同濃度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2 μmol·L-1)溶液2 ml,培養(yǎng)24 h后使用胰酶(不含EDTA)收集細胞,將5×Binding Buffer使用去離子水稀釋成1×Binding Buffer后重懸細胞,每管加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl,避光孵育5 min,采用流式細胞儀檢測樣品凋亡情況,實驗重復3次。

四、Western blot檢測細胞中蛋白表達

取對數(shù)生長期細胞,以3×105/孔的細胞密度接種于6孔板,待細胞貼壁后裂解并刮下細胞,離心后去掉其他細胞成分,使用微量核酸蛋白定量儀測定各蛋白樣品的濃度及純度;加入蛋白上樣緩沖液后振蕩離心,取蛋白樣品于10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離之后再進行轉(zhuǎn)膜、封閉,在4 ℃條件下與一抗孵育過夜;二抗室溫孵育1 h,采用化學發(fā)光法檢測蛋白表達,并進行灰度值分析。

五、轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒檢測蛋白間關系

取2個4 ml EP 管,1管加入Opti-MEM 125 μl、Lipofectamine 3000 5 μl,另外1管加入Opti-MEM 125 μl、P 3000 5 μl,SP1和EZH2過表達質(zhì)粒2 μg,然后將兩管液體輕輕混勻后于室溫靜置5 min,加入轉(zhuǎn)染孔中對DU145細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染24 h,再使用PPⅠ作用于DU145細胞24 h后,提取蛋白行Western blot檢測。

六、雙熒光素酶報告基因檢測EZH2啟動子活性

取對數(shù)生長期細胞,以5×104/孔細胞密度及500 μl培養(yǎng)液/孔體積接種于24孔板,待細胞貼壁后,每孔配制化學轉(zhuǎn)染試劑Opti-MEM 50 μl、Lipofectamine 3000 1 μl 、 P 3000 1 μl和EZH2啟動子質(zhì)粒(p-EZX-PG04-EZH2)0.5 μg的混合液,靜置5 min后加入孔中,轉(zhuǎn)染24 h后進行分組處理,每孔吸出100 μl上清到對應離心管(每個樣品備2個),取其中1份含上清離心管置于65 ℃水浴鍋中15 min,另外1份含上清離心管則置于室溫;將未水浴和水浴后的上清樣品各取出10 μl移入底部不透光的96 孔板中,按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書配制試劑并對應加入樣品后振板5 s,使用熒光酶標儀檢測、收集數(shù)據(jù)并計算未水浴樣品與水浴樣品的熒光強度值。

七、統(tǒng)計學方法

結 果

一、PPⅠ對DU145細胞存活率的影響

與空白組相比,隨著給藥濃度和時間的延長,DU145細胞存活率逐漸下降,并呈劑量和時間依賴性,表明PPⅠ能抑制DU145細胞的增殖(圖1)。

圖1 不同濃度PPⅠ對DU145細胞存活率的影響

二、PPⅠ對DU145細胞凋亡的影響

與空白組相比,隨著給藥濃度的增加,DU145細胞的早期凋亡率逐漸增加,表明PPⅠ以劑量依賴性誘導DU145細胞凋亡(圖2)。

A:4組細胞的早期凋亡散點圖(各組右下象限所示為早期凋亡細胞);B:4組細胞的早期凋亡率(與空白組相比,*P<0.05,**P<0.01)圖2 流式細胞儀檢測不同濃度PPⅠ對DU145細胞早期凋亡的影響

三、PPⅠ對p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達的影響

使用0.8 μmol·L-1PPⅠ作用于DU145細胞,采用Western blot檢測第0、0.5、2、4、8、24 h時p-ERK1/2與ERK1/2蛋白的表達。隨著時間的推移,PPⅠ逐漸增加p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達,與0 h時相比,p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達在2 h開始有明顯差異,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 DU145細胞p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達電泳圖

四、PPⅠ對SP1、EZH2蛋白表達的影響

使用不同濃度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μmol·L-1)作用于DU145細胞24 h后,隨著給藥濃度的增加,SP1與EZH2蛋白的表達逐漸降低,與空白組比較,SP1與EZH2蛋白的表達均從1.2 μmol·L-1開始明顯降低(P<0.05),見圖4。

圖4 DU145細胞SP1、EZH2蛋白表達電泳圖

五、抑制ERK1/2后PPⅠ對SP1表達的影響

使用ERK1/2抑制劑(PD98059)作用于DU145細胞2 h,再加入0.8 μmol·L-1PPⅠ處理24 h后檢測SP1的表達。與空白組相比,PPⅠ組SP1表達降低(P<0.05);與PPⅠ組相比,ERK1/2抑制劑+PP Ⅰ組SP1表達增加(P<0.05),見圖5。

六、SP1過表達對EZH2蛋白表達的影響

PPⅠ(0.8 μmol·L-1)組及PPⅠ+空白質(zhì)粒組EZH2蛋白的表達較空白組及空白質(zhì)粒組偏少,而PPⅠ+SP1過表達質(zhì)粒組 EZH2蛋白的表達較PPⅠ組及PPⅠ+空白質(zhì)粒組相比偏高(P<0.05),見圖6。

A:予ERK1/2抑制劑后SP1表達電泳圖;B:抑制ERK1/2后PPⅠ對SP1表達的影響與空白組比較,*P<0.05;與PPⅠ組比較,**P<0.05)圖5 Western blot檢測抑制ERK1/2后PPⅠ對SP1表達的影響

A:予SP1過表達質(zhì)粒后EZH2蛋白表達電泳圖;B:SP1過表達對EZH2蛋白表達的影響與空白組比較,*P<0.05;與PPⅠ組比較,**P<0.05)圖6 Western blot檢測SP1過表達對EZH2蛋白表達的影響

七、EZH2過表達對SP1表達的影響

與SP1過表達檢測EZH2蛋白表達實驗結果相反,EZH2過表達不能逆轉(zhuǎn)PPⅠ對SP1表達的下調(diào)作用,PPⅠ+EZH2過表達質(zhì)粒組與PPⅠ組相比,SP1的表達無明顯差異(P>0.05),見圖7。

A:予EZH2過表達質(zhì)粒后SP1表達電泳圖;B: EZH2過表達對SP1表達的影響與空白組比較,*P<0.05)圖7 Western blot檢測EZH2過表達后對SP1表達的影響

八、予PPⅠ及SP1過表達檢測EZH2啟動子活性

PPⅠ組(0.8 μmol·L-1)EZH2啟動子活性與空白組及空白質(zhì)粒組相比偏低,PPⅠ+SP1過表達質(zhì)粒組的EZH2啟動子活性與PPⅠ組及PPⅠ+空白質(zhì)粒組相比偏高(P<0.05),見圖8。

A:予SP1過表達質(zhì)粒后SP1表達電泳圖;B:PPⅠ和SP1過表達對EZH2啟動子活性的影響與空白組比較,*P<0.05;與PPⅠ組比較,**P<0.05)圖8 Western blot檢測PPⅠ和SP1過表達對EZH2啟動子活性的影響

討 論

PPⅠ已被證實具有良好的抗腫瘤活性,可通過多種抗癌機制對多種腫瘤細胞發(fā)揮抑制作用[6-8]。對于形成機制復雜且預后較差的CRPC,PPⅠ或許能成為治療CRPC或逆轉(zhuǎn)CPRC細胞從激素依賴到非依賴的新型靶向藥物。

本研究以人CRPC DU145細胞為研究對象,發(fā)現(xiàn)PPⅠ以劑量及時間依賴性方式抑制DU145細胞生長,以劑量依賴性方式誘導DU145細胞凋亡。與空白組相比,DU145細胞的存活率和早期凋亡率從PPⅠ濃度0.4 μmol·L-1開始時已產(chǎn)生明顯差異,當PPⅠ濃度增至0.8 μmol·L-1時,DU145細胞存活率顯著降低,早期凋亡率顯著增加,表明少量PPⅠ即可對DU145細胞產(chǎn)生高效抑制作用。多項研究也表明PPⅠ能以低劑量誘導多種癌細胞凋亡,并可抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)耐藥等[9-13]。因此,我們推測PPⅠ也能夠通過相關凋亡通路誘導DU145細胞凋亡,抑制癌細胞的增殖,發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

ERK1/2是MAPK信號通路的重要一員,參與細胞分裂、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、自噬及免疫等方面的調(diào)控,ERK1/2相關通路激活后可明顯抑制包括PCa在內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,是治療腫瘤的關鍵靶點[14-15]。本研究結果顯示,隨著PPⅠ給藥濃度增加,細胞內(nèi)p-ERK1/2與ERK1/2的表達逐漸上調(diào),提示PPⅠ可通過調(diào)節(jié)ERK1/2通路來誘導DU145細胞調(diào)亡。

SP1是一種特異性DNA結合蛋白,廣泛存在于細胞核內(nèi),可通過多個信號通路包括ERK1/2通路來調(diào)控血管生成、細胞周期、癌和抑癌基因等因子的轉(zhuǎn)錄及表達,從而促進腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移,并抑制腫瘤細胞的凋亡[16-17];而EZH2是一種重要的甲基轉(zhuǎn)移酶,其作為核心催化亞基與其他成員形成PRC2,并通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性進而促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥及抑制凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)EZH2在PCa細胞中過表達或產(chǎn)生突變,這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預后密切相關[18]。本研究結果顯示,細胞內(nèi)SP1與EZH2蛋白的表達隨PPⅠ給藥濃度的增加而逐漸降低,提示PPⅠ可調(diào)控SP1和EZH2的表達,在此基礎上,我們猜測ERK1/2可能是SP1與EZH2的上游調(diào)控蛋白。

本研究加入ERK1/2抑制劑(PD98059)后,發(fā)現(xiàn)其逆轉(zhuǎn)了PPⅠ對SP1表達的下調(diào)作用,證明了ERK1/2可調(diào)控SP1的表達;同時, SP1過表達可逆轉(zhuǎn)PPⅠ對EZH2表達的下調(diào)、逆轉(zhuǎn)PPⅠ對EZH2啟動子活性的抑制作用,而EZH2過表達未能逆轉(zhuǎn)PPⅠ對SP1表達的下調(diào),提示了SP1是EZH2的上游調(diào)控因子和上游促腫瘤細胞生長因子,而EZH2則是SP1的下游因子,與已有研究相符[19-21]。

綜上所述,PPⅠ誘導CRPC DU145細胞早期調(diào)亡和抑制其增殖的機制可能是通過調(diào)控ERK1/2、SP1與EZH2信號通路實現(xiàn)的。但細胞內(nèi)蛋白多樣且作用復雜,各類腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展及代謝都存在差異,PPⅠ是否真正通過對上述蛋白的調(diào)控機制來誘導DU145細胞凋亡仍未能明確。后續(xù)研究仍需深入探究PPⅠ、ERK1/2、SP1、EZH2與真核細胞內(nèi)的各種凋亡因子之間的相關性,以明確PPⅠ是否可通過調(diào)控ERK1/2、SP1與EZH2信號通路來誘導DU145細胞凋亡。同時,本研究僅在細胞水平進行探索,下一步仍需進行裸鼠荷瘤實驗驗證PPⅠ的抗癌活性與濃度普適性,從而為開發(fā)和利用PPⅠ治療PCa提供理論依據(jù)。