葉面噴施殼聚糖緩解低溫處理對絲瓜幼苗的影響*

練華山，周艾玲，梁 樂，李煥秀，唐 懿

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 園藝研究所，四川 成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都 611130)

低溫是影響植物地理分布的主要因素之一，也會影響作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量，威脅作物的生產(chǎn)和糧食安全[1]。低溫脅迫(0～15 ℃)可刺激植物質(zhì)膜中的冷受體觸發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，對細(xì)胞、代謝和分子功能造成慢性或長期損傷[2-3]；可對植物葉片葉綠素含量的積累造成影響，從而影響植物對光的吸收，降低光合作用[4]；還會打破植物體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，積累過量的活性氧和丙二醛(MDA)，導(dǎo)致植物受到低溫?fù)p傷甚至死亡。為了適應(yīng)低溫環(huán)境，植物通過多種因子的調(diào)節(jié)作用重塑植物代謝系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)。滲透調(diào)節(jié)是植物對低溫環(huán)境的適應(yīng)性，植物通過控制滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) (如可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸等)保持細(xì)胞正常代謝和維持細(xì)胞膨壓，緩解低溫對植物的傷害[5]。在長期環(huán)境適應(yīng)中，植物可以通過多種途徑清除活性氧自由基，其中，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是植物體內(nèi)自由基清除劑，它們共同作用使植物體內(nèi)自由基維持正常水平，從而防止自由基對植物造成氧化損傷[6]。礦質(zhì)元素是影響植物生長的主要因素之一，其中氮(N)和磷(P)是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的主要組成部分,如蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶以及一些植物激素，低溫會限制植物對礦質(zhì)元素的吸收，進(jìn)而影響植物的耐冷性[7]。另外，鉀(K)是植物細(xì)胞內(nèi)重要的陽離子，也參與維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓和酸堿平衡。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種提高植物耐冷性的方法，其中，外源噴施植物激素或植物生物刺激素是簡單可行的方法之一。

植物生物刺激素是一種不同于其他肥料的物質(zhì)，低劑量應(yīng)用可以促進(jìn)植物生長，為植物體內(nèi)許多復(fù)雜的生化反應(yīng)提供有益元素或有機(jī)化合物，并且通過影響多種代謝途徑直接調(diào)控植物的生命進(jìn)程[8-9]。植物刺激素是緩解生物[10]和非生物脅迫[11-13]及提高作物品質(zhì)[14]的物質(zhì)或微生物，主要包含腐植酸、殼聚糖、幾丁質(zhì)及其衍生物和海藻提取物等。殼聚糖具有溶解性、低毒性、可被生物降解性、誘導(dǎo)抗病性和食用性等特性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等[8]。殼聚糖可通過增加植物細(xì)胞滲透性來提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收，促進(jìn)根系發(fā)育、提高植物光合作用、調(diào)節(jié)作物生長和誘導(dǎo)植物抗逆性[8]。在辣椒[15]、黃瓜[12,16]、水稻[11]和草莓[13]的研究中發(fā)現(xiàn)：外源殼聚糖能夠誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)，提高植株耐冷性，促進(jìn)植物生長。外源殼聚糖通過增加光合作用速率、調(diào)節(jié)可溶性糖和脯氨酸含量、提高抗氧化酶活性和相關(guān)基因的表達(dá)量等途徑降低活性氧含量[17]。殼聚糖處理一方面可以促進(jìn)光合色素和蛋白質(zhì)等合成；另一方面，能夠增加MDA 含量、提高抗氧化酶以及與氮代謝有關(guān)的酶活性，提高植物對非生物脅迫的抗逆性[18-19]。此外，殼聚糖在許多植物中通過葉面施用而被用作防潮劑，從而減少了用水量并確保免受其他不利影響，基于這種有益特性，殼聚糖被用于可持續(xù)農(nóng)業(yè)實(shí)踐中[20]。

絲瓜(Luffa cylindrical)是葫蘆科(Cucurbitaceae)絲瓜屬(Luffa)一年生攀緣草本植物，又名布瓜、天羅等，根系發(fā)達(dá)，且再生能力較強(qiáng)[21]，具有順氣健脾、清涼解毒和潤膚美容等功效，是一種具有良好保健功效的蔬菜[22]。絲瓜原產(chǎn)于印度，廣泛栽培于熱帶和溫帶地區(qū)，不耐低溫[23]。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，春季提早栽培會遭遇“倒春寒”，不僅影響絲瓜幼苗生長發(fā)育，也會影響其后期的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，本研究以絲瓜幼苗為材料，探討低溫處理下葉面噴施不同質(zhì)量濃度殼聚糖對絲瓜幼苗光合色素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性以及礦質(zhì)元素吸收的影響，以期篩選出提高絲瓜幼苗耐冷性的最適殼聚糖質(zhì)量濃度，并為殼聚糖的實(shí)踐應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以四川省內(nèi)江市威遠(yuǎn)縣地方品種鐵絲瓜為試驗(yàn)材料，其果肉不易褐變，品質(zhì)佳，種子由成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院提供。殼聚糖購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021 年9—11 月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)進(jìn)行。2021 年9 月，選擇籽粒飽滿的絲瓜種子，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的過氧化氫溶液中消毒10 min，隨后用超純水洗凈，均勻放置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，保持充足水分，于28 ℃人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，露白后種植于裝有基質(zhì)(V珍珠巖∶V蛭石=1∶1)的55 孔穴盤中，待幼苗長至兩葉一心時(shí)，挑選長勢一致的幼苗移栽至裝有上述基質(zhì)的營養(yǎng)缽中(直徑9 cm，高7.5 cm)，每盆1 株，放入平底穴盤中，每個(gè)平盤18 盆幼苗。移栽后進(jìn)行常規(guī)管理，每2 d 用改良Hoagland 營養(yǎng)液澆灌1 次，每次每個(gè)穴盤1 L。改良Hoagland 營養(yǎng)液配方為：四水硝酸鈣945.000 mg/L、硝酸鉀506.000 mg/L、硝酸銨80.000 mg/L、磷酸二氫鉀136.000 mg/L、七水硫酸鎂493.000 mg/L、鐵鹽溶液2.500 mg/L、碘化鉀0.830 mg/L、硼酸6.200 mg/L、硫酸錳22.300 mg/L、硫酸鋅8.600 mg/L、鉬酸鈉0.250 mg/L、硫酸銅0.025 mg/L、氯化鈷0.025 mg/L。待絲瓜幼苗長到4～5 片真葉時(shí)，葉片均勻噴施不同質(zhì)量濃度(0、25、50、100 和200 mg/L)的殼聚糖溶液，直至葉面形成水滴而不滴落，每盆噴施約25 mL。每2 d 噴施1 次，連續(xù)噴3 次，噴施處理后自然生長48 h 進(jìn)行低溫處理。

低溫處理前，將絲瓜幼苗置于人工智能氣候箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(培養(yǎng)期間每2 d 澆灌1 次改良Hoagland 營養(yǎng)液)，環(huán)境條件為：晝/夜溫度25 ℃/18 ℃，光照周期12 h/12 h (晝/夜)，光照強(qiáng)度300 μmol/(m2·s)，相對濕度75%。預(yù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行低溫處理，環(huán)境條件為：晝/夜溫度8 ℃/8 ℃，光照周期、光照強(qiáng)度和相對濕度同預(yù)培養(yǎng)。絲瓜幼苗在智能人工培養(yǎng)箱內(nèi)隨機(jī)排列，低溫處理24 h后取樣進(jìn)行指標(biāo)測定。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置不噴施殼聚糖溶液的常溫對照處理。每個(gè)處理6 盆，每盆設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 光合色素含量

稱取葉片0.2 g，采用浸泡法(V乙醇∶V丙酮=1∶1)測定并分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素的含量[24]。

1.3.2 相對電導(dǎo)率和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

稱取0.1 g 用0.5 cm 直徑打孔器打孔的葉片，放入50 mL 離心管中，加入去離子水30 mL，放在搖床上150 r/min 遮光搖6 h。用電導(dǎo)儀測定去離子水電導(dǎo)率(S0)和浸泡液電導(dǎo)率(S1)，再將浸泡液沸水浴30 min，冷卻至室溫后測定溶液電導(dǎo)率(S2)，并計(jì)算相對電導(dǎo)率：相對電導(dǎo)率=(S1-S0)/(S2-S0)×100%。可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯G-250 法測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[25]。

1.3.3 抗氧化酶活性

取葉片1.0 g，加入預(yù)冷的50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.8 含有聚乙烯吡咯烷酮1.0 g、2 mmol/L二硫蘇糖醇和0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸)于冰上研磨，定容至8 mL。在10 000 r/min 下低溫離心10 min，取上清液進(jìn)行酶活性測定。SOD 活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，以每分鐘內(nèi)A470 變化0.1 為1 個(gè)酶活單位；CAT 活性采用高錳酸鉀滴定法測定，以每克鮮質(zhì)量樣品1 min 內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示[25]。

1.3.4 N、P、K 含量

取烘干、粉碎并過篩的幼苗葉片0.2 g，加少量水和濃H2SO4溶液5 mL，搖勻過夜，采用硫酸—過氧化氫消煮法進(jìn)行消煮，過濾后定容至100 mL。分別用凱氏定氮法、鉬銻抗比色法和火焰分光光度法測定N、P、K 含量[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 繪圖，用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并進(jìn)行Duncan’s 差異顯著性分析。數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗光合色素含量的影響

由圖1 可知：與常溫對照相比，低溫處理后絲瓜幼苗葉片中的葉綠素a 和類胡蘿卜素含量顯著降低，葉綠素b 和總?cè)~綠素含量也降低，但差異未達(dá)到顯著水平；與常溫和低溫對照相比，葉面噴施25 mg/L 殼聚糖可顯著提高絲瓜幼苗葉片的光合色素含量，較低溫對照分別增加23.90%、40.30% 和 30.80%；當(dāng)葉面噴施 50、100 和 200 mg/L殼聚糖時(shí)，絲瓜幼苗葉片的光合色素含量較常溫和低溫對照無顯著變化或顯著降低，且均低于25 mg/L 殼聚糖處理。

圖1 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗光合色素含量的影響Fig.1 Effects of chitosan on the photosynthetic pigment content of loofah seedlings under low temperature treatments

2.2 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗相對電導(dǎo)率的影響

由圖2 可知：低溫處理后，絲瓜幼苗的相對電導(dǎo)率較常溫對照顯著提高72.10%；葉面噴施不同質(zhì)量濃度殼聚糖后，絲瓜幼苗的相對電導(dǎo)率均較低溫對照下降，但均顯著高于常溫對照。其中，與低溫對照相比，葉面噴施25 mg/L 殼聚糖的絲瓜幼苗相對電導(dǎo)率顯著降低24.60%，但隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的升高，其相對電導(dǎo)率呈上升趨勢，且與低溫對照無顯著差異。

圖2 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of chitosan on the relative conductivity of loofah seedlings under low temperature treatments

2.3 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

由圖3 可知：葉面噴施不同質(zhì)量濃度的殼聚糖可提高絲瓜幼苗葉片中的可溶性糖和可溶性蛋白含量。與常溫對照相比，低溫處理后絲瓜幼苗的可溶性糖含量無顯著變化，但可溶性蛋白含量顯著降低。低溫脅迫下，葉面噴施不同質(zhì)量濃度的殼聚糖可提高絲瓜幼苗葉片中的可溶性糖含量，且各質(zhì)量濃度處理間無顯著差異；其中，25 和50 mg/L 殼聚糖處理后絲瓜幼苗中的可溶性糖含量顯著高于常溫對照和低溫對照，100 和200 mg/L 殼聚糖處理后的可溶性糖含量顯著高于常溫對照。與常溫對照和低溫對照相比，葉面噴施25 mg/L 殼聚糖可顯著提高絲瓜幼苗的可溶性蛋白含量；與低溫對照相比，葉面噴施100 和200 mg/L 殼聚糖可顯著提高絲瓜幼苗的可溶蛋白含量，但與常溫對照相比無顯著差異。

圖3 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of chitosan on the soluble sugar and soluble protein content of loofah seedlings under low temperature treatments

2.4 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的影響

由圖4 可知：低溫處理可顯著降低絲瓜幼苗的Pro 含量，顯著提高其MDA 含量。與常溫對照和低溫對照相比，葉面噴施25 mg/L 殼聚糖可顯著提高絲瓜幼苗的Pro 含量；噴施 50、100 和200 mg/L 殼聚糖時(shí)，各處理間絲瓜幼苗的Pro 含量無顯著差異，且均顯著低于噴施25 mg/L 殼聚糖處理、顯著高于低溫對照。此外，與常溫和低溫對照相比，葉面噴施25 mg/L 殼聚糖后絲瓜幼苗的MDA 含量分別顯著下降18.60%和30.90%；噴施50 和200 mg/L 殼聚糖絲瓜幼苗的MDA 含量顯著高于常溫對照，但與低溫對照無顯著差異；噴施100 mg/L 殼聚糖絲瓜幼苗的MDA 含量顯著低于低溫對照，但與常溫對照無顯著差異。

圖4 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的影響Fig.4 Effects of chitosan on the contents of proline (Pro) and malondialdehyde (MDA) in loofah seedlings under low temperature treatments

2.5 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5 可知：與常溫對照相比，低溫處理可顯著降低絲瓜幼苗的SOD、POD 和CAT 活性；與低溫對照相比，葉面噴施25 mg/L 殼聚糖可顯著提高3 種抗氧化酶的活性；隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的升高，3 種抗氧化酶活性總體呈下降趨勢。

圖5 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of chitosan on the activity of antioxidant enzymes in loofah seedlings under low temperature treatments

2.6 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗N、P、K 含量的影響

圖6 顯示：與常溫對照相比，低溫處理可顯著降低絲瓜幼苗的N 和P 含量(分別降低37.90%和15.30%)、顯著提高K 含量(提高6.69%)；與低溫對照相比，噴施25 mg/L 殼聚糖可顯著提高絲瓜幼苗的N、P、K 含量；隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的升高，絲瓜幼苗的N、P、K 含量總體呈下降趨勢。

圖6 殼聚糖對低溫處理下絲瓜幼苗N、P、K 含量的影響Fig.6 Effects of chitosan on the N,P and K contents of loofah seedlings under low temperature treatments

3 討論

作為中國常見的瓜類，絲瓜的生長發(fā)育和地理分布主要受限于溫度。低溫環(huán)境干擾絲瓜的光合作用、呼吸作用、蒸騰作用等生長和生理活動，使絲瓜代謝紊亂，對絲瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響[3]。在絲瓜的光合作用中，葉綠素具有吸收和轉(zhuǎn)換光能的作用，從而影響植物光合作用對光能的吸收與轉(zhuǎn)化，并且能夠影響植物的衰老程度[27]。前人研究表明：殼聚糖能夠改善蔬菜幼苗的光合作用性能，提高光合色素含量[9,15]。在本研究中，噴施殼聚糖可緩解低溫處理下絲瓜幼苗葉片光合色素含量的下降，但噴施不同質(zhì)量濃度的殼聚糖表現(xiàn)有所不同，其中，絲瓜幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均在25 mg/L 殼聚糖處理時(shí)最高。這與殼聚糖能顯著提高水稻[11]、草莓[13]和茄子[28]等葉片光合色素含量的研究結(jié)果一致，其原因可能是殼聚糖可有效抑制低溫下葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)紊亂、被膜內(nèi)陷或破裂，促進(jìn)葉綠體形成和葉綠素合成[29]；也有可能是殼聚糖可緩解低溫引起的光合電子傳遞率下降和光合作用相關(guān)酶活性降低[30]。

遭遇低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以提高植物的耐冷性。低溫脅迫可提高植物體內(nèi)的相對電導(dǎo)率以應(yīng)對植物失水[31-32]，本研究結(jié)果與之類似。本研究中，葉面噴施殼聚糖不僅降低了絲瓜幼苗的相對電導(dǎo)率，還提高了低溫處理下絲瓜幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro 含量，這與前人對水稻幼苗[33]和黃瓜幼苗[12]的研究結(jié)果類似。與常溫對照相比，低溫處理使絲瓜幼苗葉片中K 元素含量上升，分析其原因可能是K+為調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢的重要組分，其含量增加有利于提高植株的耐冷性[34]。在低溫脅迫下，胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)含量增加，而胞內(nèi)滲透勢隨之降低，植物可從外界吸收水分，防止細(xì)胞過度脫水，從而減少低溫對細(xì)胞的傷害[35]。外源殼聚糖能夠緩解低溫造成的細(xì)胞膜破壞而導(dǎo)致的電解質(zhì)外滲，同時(shí)促進(jìn)可溶性物質(zhì)的增加。

SOD、POD 和CAT 作為植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除活性氧、抑制MDA 積累，維持體內(nèi)氧代謝平衡，保持細(xì)胞的穩(wěn)定性和完整性。在植物的正常發(fā)育過程中，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，不會使細(xì)胞遭受氧化損害。姜秀梅[36]研究發(fā)現(xiàn)：Pro 可通過線粒體電子傳遞鏈誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)和保護(hù)蛋白含量增加，同時(shí)啟動抗低溫代謝途徑，從而緩解植物遭受的低溫傷害。本研究中，殼聚糖處理絲瓜幼苗可提高低溫下葉片的Pro 含量和抗氧化酶活性，降低MDA 含量，表明殼聚糖對低溫處理具有緩解作用。該結(jié)論與前人對草莓[13]和水稻[37]的研究結(jié)論一致，即低溫處理下，噴施殼聚糖可通過提高葉片的抗氧化酶活性和降低MDA含量來提高植物的耐冷性。殼聚糖可能增強(qiáng)了絲瓜幼苗清除活性氧的能力，緩解了其在細(xì)胞膜系統(tǒng)上誘發(fā)的膜脂過氧化作用，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，減緩絲瓜幼苗的氧化損傷。

礦質(zhì)元素作為植物體的組成成分，參與植物的各種生理代謝，是維持植物生命活動所需的物質(zhì)。低溫導(dǎo)致植物體內(nèi)部分礦質(zhì)元素的運(yùn)輸受阻，本研究中，與常溫對照相比，低溫使得絲瓜幼苗葉片中N 和P 元素含量下降，該結(jié)果與低溫脅迫對番茄[34]和黃瓜[7]幼苗礦質(zhì)元素含量的影響一致，分析其原因可能是低溫直接影響根系生長，從而影響對礦質(zhì)元素的吸收或使葉片蒸騰作用減弱，導(dǎo)致礦質(zhì)元素運(yùn)輸減慢[38]。施用殼聚糖后絲瓜幼苗的N 和P 含量增加，說明殼聚糖能緩解低溫對礦質(zhì)元素吸收和運(yùn)輸?shù)挠绊憽?/p>

4 結(jié)論

葉面噴施殼聚糖可增加絲瓜幼苗葉片的葉綠素含量，提高對光能的吸收和轉(zhuǎn)化，有利于其光合作用；可通過提高抗氧化酶活性、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及降低葉片相對電導(dǎo)率和MDA 含量維持葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和增強(qiáng)絲瓜幼苗的耐冷性；可提高對礦質(zhì)元素的吸收。其中，以25 mg/L殼聚糖處理效果最好。本研究結(jié)果為殼聚糖的實(shí)際應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。