BRAF V600E基因檢測對超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類甲狀腺結節(jié)良惡性的鑒別診斷價值

付敬杰,韋娜,史銀花,許晶晶

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450000)

隨著影像學檢查的普及,甲狀腺結節(jié)的檢出率越來越高[1]。術前病理診斷不僅決定是否需要手術,還為手術范圍、手術策略的確定提供了可靠的依據,因此在術前準確篩選出甲狀腺惡性結節(jié)是非常重要的[2]。美國甲狀腺學會(American Thyroid Association,ATA )于2015年發(fā)布的《成人甲狀腺結節(jié)與分化型甲狀腺癌指南》[3]指出,超聲診斷為“高?！钡募谞钕俳Y節(jié)的惡性腫瘤發(fā)生率為70%～90%,此類結節(jié)應在超聲引導下細針穿刺活檢[4]。然而,細針穿刺得到的標本無法診斷或標本不滿意,即細胞學Bethesda Ⅰ類[5]的概率為10%～20%[6]。對于細胞學無法診斷的甲狀腺結節(jié),Bethesda指南給出的建議是3個月后重復細針穿刺,然而由于重復細針穿刺的費用較高,且時間間隔較長,有必要尋找一種特異性較高的檢測手段來提高此類結節(jié)的惡性檢出率。近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展,在甲狀腺結節(jié)的診斷和預后評價中,大量的分子標志物被引用進來。BRAFV600E基因突變是甲狀腺惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要遺傳事件[7]。本文探討B(tài)RAFV600E基因檢測對超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結節(jié)良惡性的鑒別診斷價值,以及與BRAFV600E突變相關的臨床超聲表現。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年3月至2019年6月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院超聲檢查提示高危且細胞學判讀為Bethesda Ⅰ類(圖1)的患者共780例,其中70例接受BRAFV600E基因檢測和手術治療。將這70例患者納入研究,其中男12例(17.1%),女58例(82.9%)。經組織病理證實的良性甲狀腺結節(jié)有17例(24.3%),其中結節(jié)性甲狀腺腫11例,結節(jié)性甲狀腺腫伴纖維化、鈣化6例;惡性甲狀腺結節(jié)有53例,其中甲狀腺乳頭狀癌(圖2)50例,甲狀腺微小乳頭狀癌3例。

A為低倍鏡下可見大量囊性成分,未見甲狀腺濾泡細胞團(HE染色,放大倍數4×10);B為高倍鏡下可見少許炎細胞,雜質成分,未見甲狀腺濾泡上皮細胞(HE染色,放大倍數10×10)。

A為低倍鏡下組織排列紊亂,局部形成分枝狀的乳頭結構(HE染色,放大倍數10×10);B為高倍鏡下腫瘤細胞的極向紊亂,核增大,重疊,部分呈毛玻璃樣核,可見核溝(HE染色,放大倍數40×10)。

1.2 納入排除標準納入標準:(1)超聲判讀為高危且細胞學判讀為Bethesda Ⅰ類的結節(jié);(2)接受BRAFV600E基因檢測和手術治療;(3)無頸部放射治療史;(4)具備完整的臨床病歷資料。排除標準:(1)無最終組織病理結果;(2)重要臨床資料缺如;(3)既往有其他腫瘤病史。具體流程如圖3。

圖3 納入流程圖

1.3 檢查方法及診斷標準

1.3.1超聲 囑患者平躺于診療床上,選用多普勒超聲儀器,配置7.5～12 MHz的高頻線陣探頭進行超聲檢查。高危結節(jié)[8]是指:(1)實性、低回聲結節(jié)。(2)同時滿足以下1項或多項可疑惡性超聲征象:①邊緣不規(guī)則;②微鈣化;③縱橫比>1;④邊緣鈣化中斷,低回聲突出鈣化外;⑤侵犯甲狀腺被膜。

1.3.2超聲引導下細針穿刺及BRAFV600E基因檢測 (1)由同一位高級細胞技術醫(yī)生在超聲引導下將穿刺針進入目標結節(jié),拔出針芯,在結節(jié)內反復提插穿刺針,充分取材后退出穿刺針;(2)每個穿刺部位應至少穿刺2～3次,并將穿刺物放入30 mL清洗液的離心管內;(3)離心(1 200g離心5 min),去除上清液;(4)將樣本瓶靜置15 min后,使用T1200/T5000/T5000AL制片,并將剩余保存液用于BRAFV600E基因檢測。細針穿刺診斷標準:按照細胞病理學Bethesda系統(tǒng)[5]將甲狀腺結節(jié)分為Bethesda Ⅰ～Ⅵ類;陽性代表BRAFV600E基因突變型,陰性代表野生型。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件,計數資料以例數和百分數(%)表示。以組織病理為金標準,構建受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析BRAFV600E基因檢測對超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結節(jié)良惡性的鑒別診斷效能;應用χ2檢驗分析與BRAFV600E基因突變相關的臨床超聲特征。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1BRAFV600E基因檢測診斷效能70例患者中,有50例(71.4%)BRAFV600E基因突變,20例(28.6%)BRAFV600E基因未突變。以石蠟切片組織病理為金標準,BRAFV600E基因檢測診斷超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類甲狀腺結節(jié)的特異度為88.2%(15/17),敏感度為90.5%(48/53),陽性預測值為96.0%(48/50),陰性預測值為75.0%(15/20),陽性率為71.4%(50/70),曲線下面積為0.894。見表1。

表1 BRAF V600E基因檢測診斷效能

2.2BRAFV600E基因突變相關的臨床資料分析將納入研究的70例患者按照BRAFV600E基因檢測結果分為兩組,即突變組和未突變組。70例患者70個甲狀腺結節(jié),49個(70.0%)結節(jié)的縱橫比≥1;58個(82.9%)結節(jié)的邊緣不規(guī)則;53個(75.7%)結節(jié)合并微鈣化。相關臨床資料分析結果顯示:患者年齡、性別和結節(jié)縱橫比兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);結節(jié)邊緣不規(guī)則、微鈣化、≥2個可疑惡性超聲征象以及惡性組織病理兩組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 BRAF V600E基因突變相關的臨床資料分析

3 討論

甲狀腺細針穿刺細胞學檢查是術前評估甲狀腺結節(jié)良惡性的常用手段[9]。標本滿意度評估是甲狀腺細針穿刺診斷不可或缺的一步,它決定了細胞學診斷結果正確與否。恰當應用滿意度評估標準,可減少細針穿刺診斷的假陰性[10]。雖然大多數細胞學檢查可以獲得明確的診斷結果,但在臨床工作中發(fā)現仍有10%～20%的甲狀腺結節(jié)被歸類為標本無法診斷或標本不滿意,即細胞學Bethesda Ⅰ類[11]。主要包含以下情況[5]:(1)甲狀腺濾泡上皮細胞團少于6團、每團少于10個濾泡上皮細胞;(2)制片原因引起的標本雜質較多、濾泡細胞被遮蓋或染色不良;(3)大量囊液成分,甲狀腺濾泡上皮細胞極少。導致細胞學無法診斷標本的原因如下:(1)穿刺者操作不當,采樣有誤,制片效果不佳;(2)結節(jié)直徑較小、存在環(huán)狀鈣化,超聲引導下細針穿刺的難度較高,細針穿刺難以獲得滿意標本[12];(3)細針穿刺能獲取滿意的濾泡細胞數量在一定程度上還取決于病變的性質,結節(jié)的高囊性容量是導致標本無法診斷或標本不滿意細胞學結果的獨立危險因素[13]。對于此類結節(jié),目前采取的措施主要以重復細針穿刺為主[14]。然而Woo等[15]發(fā)現,重復細針穿刺仍然有67.5%的概率再次得到不滿意標本,并且Choi等[16]的數據分析得出重復細針穿刺是第二次得到無法診斷結果的獨立危險因素;其次,多項研究證明再次穿刺的最佳時間是3個月之后[12,17]。但是超聲判讀為高危的甲狀腺結節(jié)有著較高(70%～90%)的惡性風險,應當盡早做出明確診斷,3個月的等待期可能會延誤治療,對患者造成心理負擔。因此,對于超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結節(jié),重復細針穿刺并非最佳選擇,需要尋找一種高效的檢測方法來區(qū)分這類結節(jié)的良惡性。甲狀腺濾泡起源的癌傾向為經過多級協(xié)同分子事件后不斷進展的一組腫瘤,其中BRAFV600E基因突變是最常見的早期驅動分子改變,其發(fā)生機制為BRAFV600E基因構象改變,激活下游傳導通路,即RAS/RAF/MEK/ERK通路,最終導致細胞轉錄增殖失控,產生一系列臨床病理表現[18]。由此看來,對于超聲提示高危、細胞學無法診斷的甲狀腺結節(jié),BRAFV600E基因檢測或許有一定的輔助診斷價值。

本研究探討了BRAFV600E基因檢測對于超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結節(jié)的臨床價值。數據顯示,超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類共70例,以組織病理為“金標準”,53例經最終組織病理證實為惡性,惡性率為75.7%。70例超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類甲狀腺結節(jié),50例發(fā)生BRAFV600E基因突變,基因突變率為71.4%。50例BRAFV600E基因突變的甲狀腺結節(jié),48例(96.0%)最終證實為惡性。甲狀腺細胞學的診斷依靠異型性的濾泡上皮細胞團,對于細針穿刺獲取的濾泡上皮細胞團質量和數量不足的結節(jié),細胞學無法做出明確診斷,但是BRAFV600E基因檢測可識別出極少量惡性腫瘤細胞。數據顯示BRAFV600E基因檢測診斷超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類甲狀腺結節(jié)的靈敏度、陽性預測值都在90.0%以上,表明BRAFV600E基因檢測對于鑒別此類結節(jié)良惡性具有較好的臨床價值[19],可以降低此類結節(jié)的漏診率。因此,在臨床上,BRAFV600E基因檢測或可代替重復細針穿刺,以輔助診斷超聲高危、細胞學Bethesda Ⅰ類的甲狀腺結節(jié)。國內外研究表明BRAFV600E基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的復發(fā)以及復發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌放射性碘治療效果欠佳相關[20-21]。一項大型meta數據分析結果表明,在甲狀腺乳頭狀癌患者中,BRAFV600E基因突變的患者淋巴結更易發(fā)生轉移[22]。由此可見,BRAFV600E基因檢測不僅可以協(xié)助診斷甲狀腺惡性腫瘤,而且對惡性結節(jié)治療方式的選擇及預后方面或有很大幫助。

BRAFV600E基因突變與臨床超聲特征的關系一直是近年來研究的熱點,大多數的研究方向主要集中在探討甲狀腺結節(jié)微鈣化、邊緣不規(guī)則以及結節(jié)縱橫比等[23],然而不同的研究結論各不相同。Helmi等[24]認為BRAFV600E基因突變與低回聲、結節(jié)鈣化和邊緣不規(guī)則有關,而與結節(jié)大小和結節(jié)內部成分無關。本研究表明患者年齡、性別和結節(jié)縱橫比與BRAFV600E基因突變無關;結節(jié)邊緣不規(guī)則、微鈣化、≥2個可疑惡性超聲征象以及惡性組織病理與BRAFV600E基因突變相關。

本研究發(fā)現2例BRAFV600E基因檢測假陽性的病例,即BRAFV600E基因突變,但細針穿刺細胞學和組織病理均為良性。這2例的組織病理結果均為結節(jié)性甲狀腺腫。以往文獻也報道過這種假陽性的病例,這種情況主要是由于檢測方法的自身機制引起的。傳統(tǒng)的熒光PCR法可靠性高,但是不夠靈敏。因此人們開始探索如ARMS-qPCR測序法、dd-PCR測序法的新興檢測方法,這些方法能顯著提高基因檢測的靈敏度,但是會造成一定的假陽性[25]。Kim等[26]發(fā)現 5例BRAFV600E基因突變,手術證實為良性的基因突變假陽性病例。DiLorenzo等[27]報告1例BRAFV600E基因突變,最終經手術證實為腺瘤樣結節(jié)甲狀腺腫的病例。然而Zhao等[28]證實ARMS-qPCR檢測雖然可造成假陽性病例,但是就總體而言,ARMS-qPCR檢測不會影響B(tài)RAFV600E突變分析對甲狀腺惡性結節(jié)的附加診斷價值。本研究BRAFV600E基因檢測方法采用Sanger測序結合ARMS-qPCR方法。另外,本研究中有5例手術病理證實為甲狀腺乳頭狀癌,但是未檢測到BRAFV600E基因突變,這可能是不合并BRAFV600E基因突變的野生型甲狀腺乳頭狀癌病例。

本文的研究意義主要包括以下幾點:(1)以往大量文獻報道BRAFV600E基因檢測對于細胞學判讀為Bethesda Ⅲ～Ⅵ類的甲狀腺結節(jié)有著較高的靈敏度、特異度,但是很少有研究探討B(tài)RAFV600E基因檢測在細胞學Bethesda Ⅰ類的診斷價值,本文發(fā)現BRAFV600E基因可將細胞學無法診斷的標本中的惡性結節(jié)篩選出來,彌補了細胞學診斷上的不足;(2)近年來很多研究探討與BRAFV600E基因突變相關的超聲病理特征,但是很少有研究報道甲狀腺結節(jié)惡性超聲征象數量是否與BRAFV600E基因突變相關,本文證實具有2個及2個以上的甲狀腺結節(jié)更易發(fā)生BRAFV600E基因突變。

綜上所述,BRAFV600E基因檢測對于鑒別細胞學Bethesda Ⅰ類、超聲高危的結節(jié)良惡性有較高的臨床價值,可以提高此類結節(jié)的惡性檢出率。甲狀腺結節(jié)微鈣化、邊緣不規(guī)則以及結節(jié)具有≥2個可疑惡性超聲征象與BRAFV600E基因突變相關。