“微-納”PCL纖維支架多級結(jié)構(gòu)對巨噬細胞極化狀態(tài)的調(diào)控

張榮妍，李曉婧，李超婧，王富軍，王 璐

(東華大學(xué) a.紡織學(xué)院,b.紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室, 上海 201620)

當人體由于機能老化或過度損傷等情況無法自愈時,需植入生物材料支架以協(xié)助其組織修復(fù)和重建[1],但外部的支架植入體內(nèi)后會引起異物反應(yīng)。反應(yīng)后期會出現(xiàn)植入支架周圍纖維囊化的現(xiàn)象,阻斷了支架與機體必需的物質(zhì)交換,最終導(dǎo)致移植失敗[2]。因此,合理設(shè)計支架材料的理化特性,將免疫反應(yīng)導(dǎo)向于組織的有利再生,這是再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵[3]。

巨噬細胞在異物反應(yīng)中占主導(dǎo)地位,不僅可以促進炎癥反應(yīng)、殺死病原體,還可以參與創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生。血液中的單核細胞到達目標組織附近后分化為巨噬細胞。巨噬細胞能夠根據(jù)所處的理化微環(huán)境改變表型,表現(xiàn)出高度可塑性[4-5],根據(jù)其表型大致分為促炎的M1型和抑炎的M2型兩類。當支架周圍的M2/M1的比率高時,人體組織再生的幾率增加。因此,通過優(yōu)化支架的設(shè)計,為巨噬細胞構(gòu)建促M2極化的微環(huán)境,有利于組織重建[6]。

植入支架的化學(xué)組成、形貌、剛度等特性會影響細胞的黏附、增殖、極化等生命活動,直接決定目標組織重建和再生的結(jié)果[7]。支架周圍的細胞通過配體-受體相互作用感知支架表面的微觀和納觀結(jié)構(gòu),激活細胞內(nèi)的機械傳導(dǎo)通路,影響細胞骨架重排、各種因子分泌以及表型的變化[8-10]。Wu等[11]利用靜電紡絲技術(shù)制備明膠納米纖維(直徑約為280 nm)膜,以模擬細胞外基質(zhì)。與平膜相比,這種支架降低了M1型巨噬細胞的極化,減輕了炎癥反應(yīng)。Patel等[12]設(shè)計一種具有雙模態(tài)的納米尺度形貌(即500 nm聚己內(nèi)酯(polycaprolactone, PCL)纖維上涂層25 nm碳納米管)的支架,這種支架能夠減少體內(nèi)的炎癥跡象,同時有利于血管再生。文獻[13-17]研究表明,纖維基材料的纖維直徑或表面粗糙度等參數(shù)可以在一定程度上調(diào)控巨噬細胞的極化方向,但缺少針對纖維支架本身結(jié)構(gòu)(纖維直徑、孔徑等)與纖維表面形貌復(fù)合作用下對巨噬細胞作用的研究。

纖維支架的孔徑會影響細胞向支架內(nèi)部的浸潤,其表面復(fù)合的納米結(jié)構(gòu)會改變黏附蛋白的吸附類型、數(shù)量以及構(gòu)象,影響巨噬細胞的機械傳導(dǎo)[18-19]。本研究以可降解高生物相容性的PCL為原料,通過改變PCL溶液的質(zhì)量分數(shù)調(diào)控纖維支架的孔徑,同時利用溶液誘導(dǎo)結(jié)晶的方法,在PCL纖維支架上誘導(dǎo)形成串晶結(jié)構(gòu),制備不同孔徑的微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架,同時,表征纖維支架的表面形貌、物理性能,并分析這種PCL纖維膜支架調(diào)控巨噬細胞的表型和細胞因子分泌的機制。

1 試驗部分

1.1 試驗材料及試劑

PCL(Mw=80 000 g/mol)、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma-Aldrich試劑有限公司;N-N二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇(MeOH)、三氯甲烷(CF)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙酸戊酯購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rBMSCs)、rBMSCs完全培養(yǎng)基、小鼠巨噬細胞(RAW264.7)由中國科學(xué)院上海細胞庫提供;Alexa Fluor 647標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;MMR抗體(ab64693)購自美國Abcam公司;胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰酶購自美國Thermo Fisher Scientific公司;DAPI溶液、FITC標記鬼筆環(huán)肽購自北京索萊寶科技有限公司;活/死細胞染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 不同微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的制備

小孔徑的纖維支架會導(dǎo)致細胞浸潤不足,不利于組織再生和重建[20]。在靜電紡絲的過程中,調(diào)整靜電紡絲的參數(shù),增大纖維直徑,進而增加纖維支架的孔徑[21]。本研究主要通過增加PCL的質(zhì)量分數(shù)、改變推注速度和接收距離來增大纖維支架的直徑,從而制備出大孔徑的纖維支架。表1為不同微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的制備參數(shù)。首先根據(jù)表1的紡絲溶劑體積比和PCL質(zhì)量分數(shù)配制3種紡絲液,用磁力攪拌器攪拌4 h以上直至紡絲液透明、均一、穩(wěn)定。然后按表1設(shè)置紡絲相關(guān)參數(shù)(針頭規(guī)格、推注速度、接收距離),在溫度為22～25 ℃、相對濕度為30%～40%的環(huán)境下制備不同纖維直徑和孔徑的PCL纖維支架。將制得的纖維支架在35 ℃的真空烘箱中干燥24 h,去除纖維支架上的殘留溶劑。將3種纖維支架分別記為P10、P12和P15。

為了得到具有串晶結(jié)構(gòu)的纖維支架,對試樣進行后處理。將PCL置于60 ℃水浴中加熱2 h使其溶于乙酸戊酯,配制質(zhì)量分數(shù)為0.5%的PCL溶液。待PCL溶液冷卻至室溫后,將其滴加至4 cm×4 cm的纖維支架(P10、P12和P15)上。待PCL溶液在纖維支架上誘導(dǎo)結(jié)晶40 min,形成串晶結(jié)構(gòu)后,用乙酸戊酯沖洗掉多余的溶液,將纖維膜置于通風櫥中充分風干。制得的具有串晶結(jié)構(gòu)的纖維支架記為P10-SK、P12-SK和P15-SK。

1.3 理化性能測試與表征

1.3.1 微觀形貌表征

使用場發(fā)射電子顯微鏡(SU8010型,Hitachi,

表1 不同微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的制備參數(shù)Table 1 Preparation parameters of PCL fibrous scaffolds with micro-nano multilevel structure

日本)觀察纖維支架的微觀形貌。利用ImageJ軟件測量6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架試樣的纖維直徑。每種纖維支架試樣選取100根纖維測量,結(jié)果取平均值。使用多孔材料孔徑分析儀(CFP-1100AI型,Porous Materials,美國)測定每種纖維支架試樣的孔徑分布。

1.3.2 水接觸角測試

使用接觸角測試儀(OCA15EC型,Dataphysics,德國)對6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架試樣進行靜態(tài)水接觸角測試。采用微量注射器滴加2 μL超純水至纖維支架試樣表面,拍攝表面形成的液滴,并用接觸角測試軟件處理捕獲的成像液滴。每種試樣隨機選取5個點進行測量,結(jié)果取平均值。

其次，即使有部分空調(diào)會根據(jù)回水溫度與設(shè)置的回水溫度做比對，從而去調(diào)節(jié)出水溫度，但大型中央空調(diào)水系統(tǒng)循環(huán)的周期是比較長的。周期較?？赡墉h(huán)境所需溫度已經(jīng)發(fā)生了多次改變，主機接收到的是滯后調(diào)節(jié)需求信息，而且水溫在運行過程中的損耗更是無從計量的，因此主機無法高效工作，存在大量浪費。即使有管理人員進行管理，根據(jù)環(huán)境溫度需求的改變?nèi)フ{(diào)節(jié)主機工作狀態(tài)，但也多憑主觀判斷去調(diào)節(jié)。另外，外部環(huán)境是動態(tài)的，要靠主觀了解各個環(huán)節(jié)的溫度動態(tài)變化，難以做到及時性和準確性，而主觀的調(diào)節(jié)更缺乏合理性。因此，中央空調(diào)主機能耗節(jié)能存在較大的節(jié)能潛力。

1.3.3 力學(xué)性能測試

采用中國大榮紡織有限公司的YG(B)026G-500型電子織物強力機對6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的拉伸性能進行測試。將每種PCL纖維支架試樣裁剪成尺寸為20 mm×3 mm的矩形,用臺式測厚儀測量試樣的厚度。拉伸測試參數(shù)設(shè)定為標距長度10 mm、拉伸速度10 mm/min、預(yù)加張力0.1 N。每種試樣測量5次,結(jié)果取平均值。

1.4 生物性能評價

1.4.1 細胞培養(yǎng)

采用小鼠巨噬細胞(RAW264.7,以下簡稱巨噬細胞)體外培養(yǎng)試驗評估6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架試樣對免疫細胞行為的影響。細胞培養(yǎng)液的成分為87%的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,10%的FBS,丙酮酸鈉、谷氨酰胺、雙抗各1%。在CO2體積分數(shù)為5%、溫度為37 ℃的恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)巨噬細胞。細胞隔天換液。根據(jù)細胞的狀態(tài),2～4 d傳代一次。

1.4.2 活/死細胞染色

采用活/死細胞染色試劑盒檢測6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架試樣上的細胞活性。試劑盒包含鈣黃素AM(calcein AM)和碘化丙啶(PI)。calcein AM與活細胞內(nèi)的酯酶活性作用,生成具有強烈熒光信號的綠色熒光物質(zhì)。而對于受損的細胞膜來說,PI進入細胞與核酸結(jié)合,熒光信號則放大40倍,產(chǎn)生一個明亮的紅色熒光信號的死細胞。將6種纖維支架試樣滅菌后分別置于24孔細胞培養(yǎng)板中,并向每孔滴加密度為1×105個/mL的細胞懸液1 mL,培養(yǎng)24 h,再利用磷酸緩沖鹽(PBS)溶液洗3遍,每次5 min。每孔加入PI和calcein AM的混合試劑200 μL(PI濃度為8 μmol/L,calcein AM濃度為2 μmol/L),常溫避光孵育30 min。采用倒置熒光顯微鏡(Ti-s,Nikon,日本)觀察細胞的染色情況。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

將6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架試樣滅菌后分別置于24孔細胞培養(yǎng)板中,向每孔滴加密度為1×105個/mL的細胞懸液1 mL,培養(yǎng)24 h,收集孔板內(nèi)的上清液,采用晶美生物科技公司的ELISA試劑盒測定上清液的促炎因子TNF-α、IL-4,抑炎因子IL-10、IL-6的濃度。

將6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架試樣滅菌后分別置于24孔細胞培養(yǎng)板中,向每孔滴加密度為1×105個/mL細胞懸液1 mL,分別培養(yǎng)4、24 h和4 d。到達預(yù)定時間后吸出孔板中的培養(yǎng)基,采用PBS溶液洗3次(5 min/次),去浮色。培養(yǎng)板每孔加入4%多聚甲醛,于4 ℃下避光固定細胞15 min,再用PBS溶液洗3次(5 min/次),去除多余固定液。采用0.3%TritonX-100透膜處理20 min,PBS溶液洗3次(3 min/次),向孔板內(nèi)加入5%的BSA,在室溫下封閉1 h。然后用巨噬細胞甘露醇受體(macrophage mannose receptor, MMR)抗體(稀釋比例1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。次日,PBS溶液洗3次(5 min/次),去除未結(jié)合的MMR抗體,加入Alexa Fluor647熒光二抗(稀釋比例1∶800)室溫避光孵育1 h,PBS溶液洗3次(5 min/次)。FITC標記鬼筆環(huán)肽(稀釋比例1∶200)染細胞骨架室溫避光孵育30 min,PBS溶液洗3次(5 min/次)。DAPI染細胞核室溫避光孵育10 min,PBS溶液洗2次(5 min/次)。將試樣置于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞的染色情況。利用ImageJ軟件測量PCL纖維支架熒光圖片內(nèi)熒光的平均光密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件Origin分析數(shù)據(jù)。纖維直徑和支架孔徑、接觸角、彈性模量、平均光密度等數(shù)據(jù)的計算結(jié)果記錄為平均值±標準差的形式。采用單因素方差分析和Turkey多組對比試驗分析6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架各項測試數(shù)據(jù)間是否存在顯著性差異。每種纖維支架的每項測試數(shù)據(jù)至少包含3個有效數(shù)值,顯著性差異水平p<0.05表示數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異。0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌分析

圖1為6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的SEM圖及平均孔徑。由圖1可知,通過溶液誘導(dǎo)結(jié)晶的方法在纖維支架表面成功構(gòu)建了更小尺寸的SK結(jié)構(gòu)。分析SEM圖和平均孔徑數(shù)據(jù)可知,纖維支架的平均孔徑隨著纖維直徑的增加而增大,其中P15(12.50 μm)和P15-SK(11.57 μm)的孔徑明顯大于其他4種纖維支架。雖然沒有統(tǒng)計學(xué)差異,但與P15-SK相比,P15的平均孔徑更大。圖2為不同微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的直徑分布圖,6種纖維支架呈現(xiàn)出3種不同的直徑分布。由圖2可知:P10和P10-SK的纖維平均直徑為(0.45±0.20)μm;P12和P12-SK的纖維平均直徑為(1.75±0.23)μm;P15和P15-SK的纖維平均直徑為(2.84±0.55)μm。

圖1 6種纖維支架的SEM圖及平均孔徑Fig.1 SEM images and average pore size of 6 fibrous scaffolds

圖2 6種纖維支架的纖維直徑分布圖Fig.2 Fiber diameter distribution of 6 fibrous scaffolds

2.2 接觸角分析

材料表面親水性的增加對部分細胞附著、鋪展以及細胞骨架重排有促進作用[22]。圖3為6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的水接觸角測試結(jié)果。PCL為疏水材料,光滑纖維表面的水接觸角接近140°,而具有串晶結(jié)構(gòu)的纖維支架表面的水接觸角顯著下降,這表明串晶結(jié)構(gòu)能夠顯著改善材料的疏水性。其中,P12-SK的水接觸角下降最大,平均值從137.31°(P12)降到122.67°(P12-SK),疏水性改善效果最為顯著。這可能是由于材料表面的納米串晶結(jié)構(gòu),使得材料的比表面積和表面缺陷增加,從而改善了材料的疏水性。

圖3 6種纖維支架的水接觸角Fig.3 Water contact angle of 6 fibrous scaffolds

2.3 力學(xué)性能分析

巨噬細胞會根據(jù)基質(zhì)材料的剛度調(diào)整其極化狀態(tài)、細胞因子分泌和遷移模式[23],因此需要評估材料的力學(xué)性能,重點關(guān)注纖維支架的剛度變化。圖4為6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的力學(xué)性能測試結(jié)果。由圖4(a)可知:P10和P10-SK的纖維較細,單位面積內(nèi)纖維數(shù)量多,纖維間的交點多,纖維不易沿拉伸方向取向,與其他4種纖維直徑的支架相比,拉伸曲線具有斷裂強度大、斷裂伸長率小、剛度大的特點;P15和P15-SK的拉伸曲線則表現(xiàn)為大斷裂伸長率、小斷裂強度、低剛度。由圖4(b)可知:彈性模量隨纖維直徑的增加而減小,P10、P12和P15的彈性模量分別為13.47、7.34、5.62 MPa;串晶結(jié)構(gòu)使纖維支架的彈性模量有增加的趨勢,其中P12與P12-SK差異最顯著,P12-SK的彈性模量(11.38 MPa)比P12增加了4.04 MPa。這是由于纖維上的串晶結(jié)構(gòu)增加了纖維表面的粗糙度,纖維相對滑移的阻礙被增大,纖維之間形成“結(jié)點”[24],致使支架斷裂伸長率降低,彈性模量增大。

2.4 活/死細胞染色分析

6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架的活/死細胞熒光圖片如圖5所示。由圖5可知,6種纖維支架表面的細胞生長狀態(tài)均為良好,這表明纖維表面誘導(dǎo)結(jié)晶過程不影響纖維支架的細胞相容性。

圖5 6種纖維支架的活/死細胞熒光圖片F(xiàn)ig.5 Fluorescent images of the live/dead stained macrophages on 6 fibrous scaffolds

2.5 ELISA分析

巨噬細胞會根據(jù)所處的微環(huán)鏡切換表型,釋放不同的細胞因子,影響免疫反應(yīng)的走向。本文檢測了與巨噬細胞免疫反應(yīng)相關(guān)的4種細胞因子分泌量,分析纖維支架所處的炎性環(huán)境。促炎因子(TNF-α、IL-6)能進一步傳播炎癥信號,招募更多的免疫細胞到達移植區(qū)域,促進異物巨細胞的形成[25]。抑炎因子(IL-4、IL-10)能刺激巨噬細胞朝M2型極化,有利于炎癥消退和組織重建[6]。

6種微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架培養(yǎng)24 h后巨噬細胞的細胞因子分泌量的ELISA檢測結(jié)果,如圖6所示。由圖6可知,巨噬細胞在纖維支架上培養(yǎng)24 h后,6種纖維支架上促炎因子TNF-α的分泌量沒有顯著差異。P15-SK的促炎因子IL-6的分泌量比P10-SK、P12-SK、P15低。相比光滑纖維支架(P10、P12和P15),抑炎因子IL-4在具有串晶結(jié)構(gòu)的纖維支架上(P10-SK、P12-SK和P15-SK)分泌量均較高,其中P15-SK的分泌量顯著大于其他5種纖維支架。抑炎因子IL-10在6種纖維支架上的分泌量不存在顯著性差異。值得注意的是,無論是促炎因子還是抑炎因子,P15-SK上因子的分泌趨勢總是有利于炎癥消退和組織再生。這因為P15-SK的孔徑(11.57 μm)較大,有利于巨噬細胞的浸潤;另外由于納米串晶結(jié)構(gòu)的存在,影響被吸附蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域暴露,進而影響巨噬細胞,這對組織修復(fù)產(chǎn)生積極影響[19]。

圖6 巨噬細胞相關(guān)細胞因子分泌量的ELISA檢測結(jié)果Fig.6 ELISA determination of cytokines from macrophages

2.6 細胞免疫熒光染色分析

PCL纖維支架植入后,被植入體迅速引起急性炎癥反應(yīng),招募大量巨噬細胞到達移植區(qū)域,此時的巨噬細胞一方面作為吞噬細胞清除病原體,另一方面其釋放大量細胞因子,招募更多的免疫細胞到達移植區(qū)域。在支架植入2～3 d后,進入慢性炎癥反應(yīng)階段,此時巨噬細胞主要承擔創(chuàng)傷修復(fù)和組織重建的任務(wù)。圖7為巨噬細胞在6種纖維支架上培養(yǎng)4、24 h及4 d后向M2型極化的熒光染色,紅色熒光強度表示M2型巨噬細胞表面標志物MMR的表達量,細胞核使用DAPI染色(藍色),細胞骨架使用FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色(綠色);圖8為4、24 h及4 d時M2極化表型平均光密度統(tǒng)計結(jié)果。由圖7和8可知,4 h時巨噬細胞在P15上產(chǎn)生最高的紅色熒光強度,說明M2型巨噬細胞極化最多。圖9為巨噬細胞向6種纖維支架內(nèi)部的浸潤深度。由圖9可知,巨噬細胞在P15上達到了最大的浸潤深度(84.02 μm),這有利于細胞向支架內(nèi)部長入[17]。P15纖維支架上M2型巨噬細胞極化較多的原因是其具有最大的孔徑(12.50 μm)和最低的剛度(5.62 MPa)。大孔徑有利于巨噬細胞浸潤,且材料對細胞的力學(xué)作用小,這均有利于巨噬細胞向M2型極化。

圖7 巨噬細胞在纖維支架上培養(yǎng)4、24 h和4 d后向M2型極化的結(jié)果Fig.7 M2 polarization of macrophages cultured on fibrous scaffolds for 4, 24 h and 4 d

圖8 M2極化表型平均光密度統(tǒng)計結(jié)果Fig.8 Mean optical density results of M2 polarization phenotypes

圖9 巨噬細胞向纖維支架內(nèi)部浸潤的深度Fig.9 Infiltration depth of macrophages into the fibrous scaffolds

3 結(jié) 語

結(jié)合靜電紡絲和溶液誘導(dǎo)結(jié)晶法,通過改變PCL溶液的質(zhì)量分數(shù),制備成6種具有不同表面形貌、纖維直徑、孔徑、力學(xué)性能的微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架。圍繞纖維支架結(jié)構(gòu)對巨噬細胞極化行為的影響進行研究和討論。相較于小直徑纖維支架(P10和P12),直徑較大的纖維支架(P15)具有大孔徑(12.50 μm)、低剛度(5.62 MPa)的特點。P15促進巨噬細胞向抑炎表型(M2)極化的效果最好。纖維表面有納米級突起的P15-SK纖維支架能夠促進巨噬細胞分泌更多的抑炎因子(IL-4)。結(jié)果表明,增加纖維材料的孔徑、減小纖維剛度、在纖維表面構(gòu)建納米突起結(jié)構(gòu),這些均有利于巨噬細胞向抑制炎癥表型M2的極化。由此說明,不同微-納多級結(jié)構(gòu)PCL纖維支架在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的研究前景,但是纖維支架體系構(gòu)成復(fù)雜,存在多種因素(纖維直徑、孔徑、力學(xué)性能)的相互作用,在今后的研究中,需要構(gòu)建簡化的支架模型,探索不同因素的影響范圍和趨勢。