線粒體蛋白CHCHD10與神經(jīng)退行性疾病*

王 腈 朱 笠

（中國科學(xué)院生物物理研究所，腦與認(rèn)知科學(xué)國家重點實驗室，北京 100101）

線粒體是細(xì)胞的能量工廠和信號中轉(zhuǎn)站，其主要功能除了生產(chǎn)ATP 外，還參與氨基酸和脂類等代謝物的生物合成、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持、代謝調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)和調(diào)控細(xì)胞程序性死亡等［1］。線粒體含有自身的基因組（mtDNA），該基因組含有16 596 個堿基對組成的37 個基因，編碼22 個tRNA、2 個rRNA 和13 條多肽鏈，這13 條多肽鏈分別是不同呼吸鏈復(fù)合物的組分，參與線粒體氧化磷酸化 （oxidative phosphorylation，OXPHOS）［2-3］。然而，人類細(xì)胞的線粒體含有1 200 多種蛋白質(zhì)，約98%的線粒體蛋白是由核基因組（nDNA）編碼的［4］。與大多數(shù)線粒體蛋白相似， CHCHD10 （coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 10）由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成，經(jīng)線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入線粒體，定位在線粒體膜間隙 （intermembrane space of mitochondria，IMS）和線粒體嵴上［5］。

諸多研究表明，線粒體穩(wěn)態(tài)失衡與額顳葉變性病 （frontal temporal lobar degeneration，F(xiàn)TLD；也叫額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD））、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、帕金森?。≒arkinson's disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）等多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)［6］。在一個線粒體里，mtDNA 通常以多個拷貝存在，而且一個細(xì)胞中含有成百上千個線粒體。由于細(xì)胞線粒體處于分裂和融合的動態(tài)變化中，其數(shù)目也是變化的。此外，mtDNA 組更易發(fā)生突變，其突變率比nDNA 高100~1 000 倍。因此，線粒體穩(wěn)態(tài)失衡主要包括：a. mtDNA 拷貝數(shù)明顯減少或mtDNA 缺失產(chǎn)生的mtDNA不穩(wěn)定性增強(qiáng)，可能導(dǎo)致mtDNA損耗綜合征［7-8］；b. 線粒體分裂融合動態(tài)失衡導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)改變［9］；c. ROS 水平增加［7-8］；d. OXPHOS水平改變［7-8］。

運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測CHCHD10與線粒體OXPHOS 有關(guān)，并通過實驗證明其參與線粒體呼吸鏈復(fù)合物COX 活化［10］。研究發(fā)現(xiàn)，CHCHD10的點突變S59L 會導(dǎo)致常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)出運(yùn)動神經(jīng)元損傷、認(rèn)知功能下降等癥狀［5］。隨后，CHCHD10的功能研究備受關(guān)注，而且更多與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的CHCHD10 基因突變被發(fā)現(xiàn)。本文總結(jié)了近年來已發(fā)表的關(guān)于CHCHD10結(jié)構(gòu)及其線粒體功能的文章，為研究與CHCHD10相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供新思路。

1 CHCHD10蛋白的一級結(jié)構(gòu)

CHCHD10基因位于人類第22號染色體，其編碼的蛋白質(zhì)由142 個氨基酸組成。CHCHD10 蛋白N 端的前16 個氨基酸是線粒體定位序列（mitochondrial targeting sequence，MTS），C 端99~140 位氨基酸組成其CHCH 結(jié)構(gòu)域（coiled-coilhelix-coiled-coil-helix domain），其中C102和C132，C112和C122分別形成兩對二硫鍵（圖1）。

Fig. 1 Primary structures of CHCHD10 and CHCHD2 proteins as well as the amino acid positions of various neurodegenerative diseases associated mutations圖1 CHCHD10和CHCHD2蛋白的一級結(jié)構(gòu)及其基因在FTD、ALS和AD等神經(jīng)退行性疾病中突變位點對應(yīng)的氨基酸位置

由于二硫鍵的存在，CHCHD10 通過Mia40/Erv通路進(jìn)入線粒體，最終定位在線粒體膜間隙［5］（圖2）。在HeLa細(xì)胞中，與對照相比，敲減Mia40后，進(jìn)入線粒體的CHCHD10 明顯減少。過表達(dá)Mia40，ALS 相關(guān)突變體Q108P-CHCHD10 更多地進(jìn)入線粒體［11］。CHCH結(jié)構(gòu)域在CHCHD10進(jìn)入線粒體時發(fā)揮作用。刪除CHCH結(jié)構(gòu)域或表達(dá)CHCH結(jié)構(gòu)域的疾病相關(guān)突變體（如Q108P、C122R），進(jìn)入線粒體的CHCHD10 顯著減少。然而，刪除CHCHD10的N端1~16這一段氨基酸組成的線粒體定位序列對其進(jìn)入線粒體無明顯影響［11］。但是，不同實驗室的研究結(jié)果存在差異，Burstein 等［12］發(fā)現(xiàn)，單獨刪除N 端1~16 氨基酸序列或者單獨刪除CHCH 結(jié)構(gòu)域，均會影響CHCHD10 進(jìn)入線粒體。

Fig. 2 CHCHD10 is imported into mitochondria through Mia40/Erv pathway and involved in the maintenance of the mitochondrial integrity圖2 CHCHD10通過Mia40/Erv途徑進(jìn)入線粒體并參與維持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性

2 CHCHD10疾病相關(guān)突變體

2014 年，科研人員首次在ALS-FTD 患者的病理組織中篩選到CHCHD10 的突變體S59L［5］。隨后更多與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的CHCHD10突變體被報 道， 包括與ALS 或ALS-FTD 相關(guān)的p.P12S［15］、p.R15L［16-18］、p.S59L［5，19］、p.G66V［16］、p.G66S［11］、p.P80L［18，20］、p.Y92C［21］、p.Q102H［21］、p.Q108P［11］、p.C122R［11］、p.E127K［11］，與FTD相關(guān)的p.H22Y［22］、p.P23S［22］、p.P23L［23］、p.P23T［18］、p.A32D［22］、p.A35D［18］、p.V57E［22］、p.Q82*［15］、p.Q108*［24］；與常染色體顯性運(yùn)動神經(jīng)元疾?。╝utosomal dominant motor neuron disease，MND）相關(guān)的p.R15L［25］，與常染色體顯性線粒體肌?。╝utosomal dominant mitochondrial myopathy，IMMD）相關(guān)的p.R15S［26］、p.G58R［26］、p.P80L［20］，與遲發(fā)性脊肌萎縮癥（late-onset spinal muscular atrophy，SMAJ）相關(guān)的p.G66V［27］，與2 型腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth 2，CMT2）相關(guān)的p.G66V［28］，與散發(fā)性PD相關(guān)的p.S30L［29］，與AD相關(guān)的p.A35D［30］，等等（圖1）。

3 CHCHD10與同源基因CHCHD2

CHCHD2與CHCHD10同屬于CX9C蛋白家族，二者的蛋白質(zhì)序列同源性高達(dá)58%［31］。CHCHD10與CHCHD2 存在相互作用，并且與線粒體相關(guān)蛋白形成分子質(zhì)量約為220 ku 的復(fù)合物［12，32］。通過受激發(fā)射損耗熒光顯微術(shù)（stimulated emission depletion，STED）觀察到CHCHD10 與CHCHD2沿著線粒體形成軌道樣結(jié)構(gòu)［33］。在線粒體中，CHCHD10 作為支架蛋白，輔助ARG 激酶（ABL proto-oncogene 2， nonreceptor tyrosine kinase，ABL2）調(diào)節(jié)CHCHD2 的磷酸化，進(jìn)而活化COX復(fù)合物［31］。CHCHD2 在細(xì)胞內(nèi)可單獨形成二聚體或與CHCHD10 形成異二聚體，但是CHCHD10 需與CHCHD2結(jié)合才能形成聚合物［34］。

4 CHCHD10的功能

4.1 CHCHD10與線粒體結(jié)構(gòu)完整性

MICOS （mitochondrial contact site and cristae organizing system）復(fù)合物位于線粒體內(nèi)膜上，對線粒體嵴結(jié)構(gòu)的形成和維持至關(guān)重要［14］，MICOS復(fù)合物組裝發(fā)生障礙會影響線粒體嵴結(jié)構(gòu)的完整性。CHCHD10主要定位在線粒體膜間隙中。免疫電鏡顯示CHCHD10在線粒體富集［5，34］，免疫共沉淀檢測到CHCHD10 與MICOS 復(fù)合物的Mic60/mitofilin 存在相互作用，因此Genin 等［35］認(rèn)為CHCHD10 是MICOS 復(fù)合物的組成部分。然而，后續(xù)其他研究均未能重復(fù)出上述結(jié)果，即未檢測到CHCHD10 與MICOS 復(fù)合物中Mic60/mitofilin 之間的相互作用。CHCHD10 蛋白單體分子質(zhì)量為14 ku。一維的天然膠（或非變性膠）聚丙烯酰胺凝膠電泳 （blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE） 顯 示，CHCHD10 在170 ku和220 ku與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，但在約600~720 ku處沒有檢測到CHCHD10存在［32］。免疫共沉淀或二維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-SDSPAGE）共遷移實驗，均未檢測到CHCHD10 或CHCHD2 與MICOS 復(fù)合物的Mic60 或Mic19 存在相互作用。用Mic60 或Mic19 抗體進(jìn)行免疫共沉淀，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，均未檢測到CHCHD10或CHCHD2［32］。在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶FLAG標(biāo)簽的CHCHD10，用FLAG 抗體進(jìn)行免疫共沉淀，可檢測到mitofilin，但Mic60/mitofilin 與IgG 也存在相互作用。相反，用Mic60/mitofilin 抗體結(jié)合的免疫共沉淀實驗，未檢測到CHCHD10。因此，Mic60/mitofilin 與CHCHD10 之間可能是非特異性的相互作用［12，33］。因 此，CHCHD10 是 否 是MICOS復(fù)合物的必要組成部分，目前仍存在爭議。

另外，CHCHD10 對MICOS 復(fù)合物的表達(dá)影響甚微。在ALS 相關(guān)突變體G66V-CHCHD10 患者的成纖維細(xì)胞中，MICOS 復(fù)合物中mitofilin 表達(dá)無明顯改變［36］。HeLa 細(xì)胞中，敲除CHCHD10 或CHCHD2，MICOS 復(fù)合物的組成部分Mic60/mitofilin、Mic19/CHCHD3 和Mic25/CHCHD6 均無明顯改變。CHCHD2-CHCHD10 雙基因敲除后，MICOS 復(fù)合物組成部分Mic60、Mic19/CHCHD3、Mic25/CHCHD6略微減少［34］。

雖然CHCHD10 是否屬于MICOS 復(fù)合物的組成部分存在爭議，但毫無疑問，CHCHD10對線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性維持尤為重要。CHCHD10缺失或者突變，均會影響線粒體嵴結(jié)構(gòu)的完整性。單獨敲減CHCHD10或CHCHD10-CHCHD2雙基因敲除后，線粒體嵴結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常［33-34，37］。在ALS 相關(guān)突變體S59L-CHCHD10 患者的成纖維細(xì)胞中，出現(xiàn)線粒體嵴缺失、線粒體呼吸鏈缺乏、mtDNA損傷修復(fù)障礙等異常［5，35］。在HeLa 細(xì)胞系中過表達(dá)ALS 相關(guān)突變體S59L-CHCHD10，或在S59LCHCHD10的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，線粒體嵴均是受損的［5，38-40］。不過，與上述結(jié)果不一致的是，攜帶另外一種ALS 相關(guān)突變G66V-CHCHD10 的患者，其成纖維細(xì)胞中的線粒體嵴結(jié)構(gòu)無明顯變化［36］。目前的研究結(jié)果顯示，CHCHD10參與維持細(xì)胞線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但具體以何種方式參與其中尚不明確。

4.2 CHCHD10與線粒體分裂融合

線粒體通過不斷的分裂（fission） 和融合（fusion）以維持其正常結(jié)構(gòu)和生理功能，一旦分裂和融合失去平衡將直接導(dǎo)致線粒體形態(tài)改變和功能受損。ALS 相關(guān)突變S59L-CHCHD10 患者的成纖維細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染線粒體mitoPAGFP 質(zhì)粒，在405 nm 激發(fā)光條件下連續(xù)觀察60 min，線粒體熒光強(qiáng)度減弱的速率與對照相比無明顯差異，提示S59L 突變對線粒體融合無顯著影響［5，35］。使用不同的方法進(jìn)行實驗，得到的結(jié)果略有差異。在NIH-3T3 細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染野生型或突變體CHCHD10 （如R15L、S59L） 和mito-dendra2 質(zhì)粒，48 h 后在405 nm 激發(fā)光條件下連續(xù)觀察線粒體的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染突變體的細(xì)胞中其熒光強(qiáng)度的改變速率顯著慢于對照組，提示線粒體融合受損［41］。雖然CHCHD10 突變對線粒體融合的影響因?qū)嶒灧椒ú煌嬖诓町?，但已報道的ALS 相關(guān)突變（包括S59L、R15S、G58R、G66V）在患者樣本、小鼠模型或細(xì)胞模型中，均觀察到線粒體發(fā)生片段化［5，26，36-40］。線粒體動力蛋白樣GTP 酶（mitochondrial dynamin-like GTPase）OPA1（optic atrophy 1）是調(diào)節(jié)線粒體分裂和融合的重要蛋白質(zhì)。在YME1 樣ATP 酶（YME1 like 1 ATPase，YME1L1）和鋅金屬肽酶OMA1 （OMA1 zinc metallopeptidase，OMA1）這兩種蛋白水解酶的作用下，OPA1會形成長、短兩種形式，L-OPA1參與線粒體融合過程，S-OPA1 與線粒體分裂相關(guān)，L-OPA1與S-OPA1比例失衡將影響線粒體分裂和融合，最終導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常［37，40-41］。CHCHD10突變體使線粒體片段化或許與OPA1水解相關(guān)，但是這一推測需要實驗進(jìn)一步證實。

4.3 CHCHD10與線粒體OXPHOS

OXPHOS 主要發(fā)生在線粒體內(nèi)膜上，由一系列蛋白質(zhì)復(fù)合物完成。糖、脂、蛋白質(zhì)這三大類營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入有機(jī)體后，首先被消化為小分子物質(zhì)，它們被吸收進(jìn)入細(xì)胞后，通過各種酶促反應(yīng)形成乙酰輔酶A 等中間產(chǎn)物，然后進(jìn)入線粒體三羧酸循環(huán)，最終生成CO2和H2O。在這一氧化過程中釋放的能量，通過線粒體呼吸鏈復(fù)合物供給ADP 與無機(jī)磷酸鹽，合成能量分子ATP，體內(nèi)95%的ATP都是通過線粒體的OXPHOS 合成的［42］。運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測，CHCHD10是核基因編碼的線粒體蛋白，同COX19 一樣含有CHCH 結(jié)構(gòu)域，而COX19 參與呼吸鏈復(fù)合物IV（complex IV）的形成，提 示CHCHD10 可 能 與complex IV 有 關(guān)［10］。在HeLa 細(xì)胞中，通過免疫熒光觀察到CHCHD10與線粒體存在明顯共定位，且CHCHD10主要定位在線粒體中，這一實驗證實了預(yù)測的結(jié)果［10］。而且，在HeLa 細(xì)胞中敲減CHCHD10，經(jīng)線粒體OXPHOS解偶聯(lián)劑 （carbonyl cyanide 4-（trifluoromethoxy）phenylhydrazone，F(xiàn)CCP）或寡霉素處理，或用含半乳糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞ATP 合成減少，Complex IV 活性降低［10］。隨后更多的實驗結(jié)果表明，CHCHD10 與線粒體OXPHOS水平密切相關(guān)。CHCHD10基因缺失的細(xì)胞系或攜帶CHCHD10 突變（如S59L、R15S、G58R）患者的成纖維細(xì)胞中，線粒體耗氧量減少，呼吸鏈復(fù)合物活性降低［5，11，26，32，34-35，43］。ALS 相關(guān)突變R15L-CHCHD10 患者的成纖維細(xì)胞中，線粒體OXPHOS 水平與正常對照組相比顯著降低。在突變患者的成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型CHCHD10，線粒體OXPHOS水平明顯升高，可恢復(fù)到正常對照組的水平［32］。而且，CHCHD10 的ALS 相關(guān)疾病突變患者細(xì)胞中的線粒體受損情況，與在細(xì)胞中敲除CHCHD10 基因?qū)е碌慕Y(jié)果一致［32］。然而，CHCHD10不同疾病突變體對線粒體OXPHOS的影響略有不同，如在G66V突變體患者的肌肉組織活檢樣本中，COX-negative的纖維不超過總纖維數(shù)的1%［27-28］。同樣，G66V 突變患者的成纖維細(xì)胞中，呼吸鏈復(fù)合物活性及ATP 合成均無顯著改變［36］。上述報道中均未提及CHCHD10具體以何種方式參與調(diào)節(jié)線粒體OXPHOS。

在8%低氧情況下，CHCHD10可進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合并活化轉(zhuǎn)錄抑制因子CXXC5（CXXC finger protein 5），進(jìn)而下調(diào)在啟動子處含有ORE 元件的基因表達(dá)，使COX4I2 蛋白表達(dá)下降［31］。在線粒體中，CHCHD10 可直接與COX6B 相互作用，也可作為支架蛋白，輔助ARG激酶調(diào)節(jié)CHCHD2磷酸化，進(jìn)而活化COX［31］。而CHCHD10 的疾病相關(guān)突變體（如G66V、P80L）卻失去支架作用，與CHCHD2的相互作用減弱，同時細(xì)胞耗氧量減少，ROS 水平增加［31］。此外，在細(xì)胞核中未能檢測到CHCHD10 突變體（G66V、P80L）與CXXC5 相互作用，CHCHD10對ORE元件的抑制減弱，也會導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量減少，ROS水平增加［31］。

5 CHCHD10引起神經(jīng)退行性疾病的致病機(jī)理

5.1 CHCHD10單倍劑量不足

CHCHD10既可作為線粒體結(jié)構(gòu)的組成部分參與線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整性的維持，也可作為調(diào)節(jié)因子調(diào)控線粒體呼吸鏈復(fù)合物蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。CHCHD10本身的表達(dá)降低會影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。在體外細(xì)胞實驗中，敲減CHCHD10導(dǎo)致線粒體嵴結(jié)構(gòu)發(fā)生異常［34，37］，線粒體呼吸作用減弱，呼吸鏈復(fù)合物活性降低，ATP合成減少［10-11，34］。向CHCHD10 敲除的細(xì)胞中回補(bǔ)野生型CHCH10，線粒體OXPHOS 恢復(fù)至正常水平［32］。在TDP-43 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，隨著TDP-43 誘導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病的病程加重，皮層中CHCHD10蛋白的表達(dá)量隨之降低［44］。在ALS 患者的組織樣本中，也發(fā)現(xiàn)CHCHD10的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)量與對照組相比顯著降低［44-45］。因此，CHCHD10單倍劑量不足或許與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。

5.2 CHCHD10與CHCHD2均會發(fā)生突變

CHCHD10和CHCHD2均會發(fā)生突變，且與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)（圖1），這些突變均會干擾二者之間的相互作用。CHCHD10 的突變（如G66V、P80L）在線粒體中不再作為支架蛋白，輔助ARG激酶調(diào)節(jié)CHCHD2的磷酸化，線粒體耗氧量減少，ROS 水平增加［31］。在細(xì)胞系中表達(dá)CHCHD2 的PD 相關(guān)突變體（如T61I、R145Q、Q126*），免疫共沉淀檢測到CHCHD2 突變體與CHCHD10的相互作用明顯降低［33］。但在不同細(xì)胞系中得到的實驗結(jié)果存在差異，如在HEK293T 轉(zhuǎn)染CHCHD2 突變體T61I，免疫共沉淀檢測到突變體與CHCHD10 相互作用是增加的［46］。CHCHD10疾病突變體（如G58R、 S59L、 G66V） 和CHCHD2 疾病突 變 體T61I 都能促 進(jìn)CHCHD2 與CHCHD10 形成異二聚體，導(dǎo)致蛋白聚集而損傷線粒體。因此，CHCHD2-CHCHD10異二聚體的形成可能是PD和/或ALS的新致病因素［34］。

5.3 MICOS復(fù)合物完整性缺失

MICOS復(fù)合物的核心組成部分Mic60/mitofilin與線粒體內(nèi)膜蛋白OPA1相互作用，共同調(diào)節(jié)線粒體嵴結(jié)構(gòu)的完整性。雖然CHCHD10 是否參與MICOS 復(fù)合物的組成還有待進(jìn)一步確認(rèn)，但CHCHD10 的缺失或突變確實會影響MICOS 復(fù)合物 的 完整 性。 在HEK293T 細(xì) 胞 中， 干 擾CHCHD10表達(dá)后，MICOS復(fù)合物的三個重要亞基mitofilin、Mic23 和Mic19 的蛋白質(zhì)表達(dá)量與對照組相比顯著降低。在細(xì)胞中敲減CHCHD10，使用非變性膠電泳（blue-native gel） 檢測線粒體mitofilin-OPA1 二者形成復(fù)合物的多少，發(fā)現(xiàn)在720 ku 分子質(zhì)量處mitofilin-OPA1 蛋白復(fù)合物減少了50%，另外在480 ku分子質(zhì)量處mitofilin蛋白量同樣減少了50%。在CHCHD10敲減細(xì)胞中，免疫共沉淀實驗檢測到mitofilin 與OPA1 之間的相互作用減弱，原位鄰近連接技術(shù)（in situproximity ligation assay，PLA）檢測到二者之間的相互作用減少了70%。在細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染野生型CHCHD10，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，mitofilin 和OPA1 之間的結(jié)合增加接近2倍［41］。然而，CHCHD10疾病突變體（如R15L、S59L）會破環(huán)mitofilin 與OPA1 結(jié)合，mitofilin-OPA1復(fù)合物下降了 65%［41］。 在CHCHD10 轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬中得到了同樣的結(jié)果，CHCHD10 疾病突變體（如R15L、S59L）干擾mitofilin 與OPA1之間的結(jié)合［41］。 因 此，CHCHD10 缺失或突變破壞mitofilin-OPA1 復(fù)合物形成，影響MICOS 復(fù)合物的組裝，最終破壞線粒體嵴結(jié)構(gòu)的完整性。

5.4 OMA1過度激活

鋅金屬肽酶OMA1 是ATP 酶依賴的鋅代謝酶，具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)域位于線粒體內(nèi)膜上［47］。OMA1 活化與線粒體膜電位的改變或線粒體應(yīng)激有關(guān)［37］。OMA1 主要通過兩種方式參與調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。一種方式是OPA1 水解。在線粒體應(yīng)激或者參與線粒體質(zhì)量控制的蛋白酶（如YME1L、AFG3L2、SPG7）功能缺失的情況下，OMA1被激活［37］，將L-OPA1水解成S-OPA1，L-OPA1/S-OPA1 比例失衡使線粒體分裂-融合發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體嵴的改變，表現(xiàn)為線粒體片段化［37］。在CHCHD2-CHCHD10 雙基因敲除小鼠的原纖維細(xì)胞中，線粒體嵴呈異常的環(huán)形結(jié)構(gòu)，而且，與對照小鼠相比，線粒體嵴的數(shù)目和面積均顯著降低［37］。這種異常的線粒體結(jié)構(gòu)與在MEF細(xì)胞中將OPA1敲除后的線粒體結(jié)構(gòu)相似。在正常生理狀態(tài)下，OPA1 被蛋白酶YME1 和OMA1 水解形成3條（c/d/e）S-OPA1蛋白條帶。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗證明，CHCHD2-CHCHD10雙基因敲除小鼠的原纖維細(xì)胞中OMA1 蛋白酶被激活，OMA1 水解OPA1 形 成S-OPA1 （c/e）的比例增加［37］。在HEK293 細(xì) 胞 中， 將CHCHD2、 CHCHD10、OMA1三者同時敲除，線粒體嵴密度恢復(fù)至正常水平［37］。CHCHD10突變導(dǎo)致的線粒體片段化依賴于OMA1 水解OPA1 形成S-OPA1 的過程。比如，使用CHCHD10 突變體G58R 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，OMA1 即被激活，線粒體發(fā)生片段化。在轉(zhuǎn)染G58RCHCHD10 的細(xì)胞中同時敲除OMA1，線粒體片段化程度降低［37］。因此，CHCHD2 和CHCHD10 缺失或突變導(dǎo)致線粒體嵴結(jié)構(gòu)異常與OMA1 激活、OPA1 水解增加有關(guān)。OMA1 參與調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的另一種方式是線粒體整體應(yīng)激反應(yīng)（mitochondrial integrated stress response， mtISR）激活。 在G58R-CHCHD10 蛋白異常聚集或CHCHD10 基因單倍劑量不足時，線粒體應(yīng)激使OMA1激活而切割DELE1 （DAP3-binding cell death enhancer 1），切割后的DELE1 釋放到細(xì)胞質(zhì)中與轉(zhuǎn)錄起始因子激酶HRI （eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 1）相互作用，使真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子2（eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α）磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致mtISR相關(guān)基因（包括ATF4、ATF5、CHOP）的mRNA上調(diào)，從而激活mtISR通路［48］。

5.5 線粒體能量代謝紊亂

CHCHD10 突變導(dǎo)致線粒體能量代謝發(fā)生障礙。在ALS 疾病相關(guān)突變S59L-CHCHD10 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，mtISR調(diào)節(jié)的mTORC1被激活［39］，mtISR 涉及到的一碳（1C）代謝和色氨酸代謝升高，線粒體OXPHOS 發(fā)生障礙［39，49］。mtISR 激活與S59L-CHCHD10同CHCHD2形成異二聚體有關(guān)，CHCHD10突變體與CHCHD2形成的異二聚體激活OMA1，而OMA1 的活化使mtISR 激活。長期mtISR 激活誘導(dǎo)的代謝重排導(dǎo)致氨基乙磺酸耗竭，核苷酸代謝失衡，出現(xiàn)mtDNA 耗竭，最終引起心衰［49］。半乳糖處理R15L-CHCHD10突變患者的成纖維細(xì)胞，1C 代謝發(fā)生異常，然而mTORC1 下調(diào)［50］。CHCHD2-CHCHD10 雙基因敲除也能激活mtISR，并導(dǎo)致心肌?。?7］。CHCHD2-CHCHD10雙基因敲除小鼠表現(xiàn)出的能量代謝功能缺失和CHCHD10的G58R或S59L轉(zhuǎn)基因小鼠的毒性獲得（gain of toxicity） 表 型， 均 與mtISR 密 切相關(guān)［37，39，48-49］。

5.6 PINK1-Parkin過度激活

PINK1通過招募Parkin到損傷的線粒體從而誘導(dǎo)線粒體自噬。正常情況下，PINK1進(jìn)入線粒體膜間隙內(nèi)會被線粒體PARL 蛋白（presenilinassociated rhomboid-like）切割，然后釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終被泛素蛋白酶體降解。當(dāng)線粒體受損時，PINK1在線粒體外膜上積累并被磷酸化，激活的PINK1 招募Parkin［51］。隨后Parkin 使線粒體外膜上的電壓依賴的陰離子通道（voltage dependent anion channel 1，VDAC1）和線粒體融合蛋白1/2（mitofusin 1/2，Mfn1/2）發(fā)生泛素化，誘導(dǎo)線粒體自 噬［52］。 HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染突變體S59LCHCHD10，線粒體的PINK1-Parkin 表達(dá)量與對照組相比顯著升高，線粒體發(fā)生片段化。使用PINK1抑制劑處理細(xì)胞，抑制PINK1活性，可挽回S59LCHCHD10誘導(dǎo)的線粒體損傷。在S59L-CHCHD10突變患者成纖維細(xì)胞中抑制PINK1，可挽回S59LCHCHD10 突變導(dǎo)致的線粒體片段化［38］。在S59LCHCHD10 轉(zhuǎn)基因果蠅模型中，線粒體長度減小，ATP 合成降低。在此模型中抑制PINK1 的表達(dá)后，線粒體的OXPHOS 增加，ATP 合成增加，提示S59L-CHCHD10 突變體可能是通過PINK1-Parkin自噬途徑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性；而抑制PINK1 活性可部分挽救S59L-CHCHD10 造成的線粒體損傷［38］。因此，在CHCHD10 突變體中，PINK1-Parkin 過度激活也會導(dǎo)致線粒體損傷及細(xì)胞毒性。

5.7 TDP-43在胞質(zhì)和線粒體中異常積累

TDP-43 是RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）。在正常情況下，TDP-43 蛋白定位于細(xì)胞核，參與多種RNA 代謝與加工過程，包括RNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA 前體剪接、RNA 穩(wěn)定性維持，以及miRNA 等非編碼RNA 的形成等［53］。在FTLD、ALS和部分AD患者的病理組織中，TDP-43在胞質(zhì)中異常積累并形成包涵體，這是TDP-43 蛋白病的主要病理學(xué)特征［54-55］。在病理情況下，TDP-43 可從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，形成聚集體，并在某些因子的幫助下進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體嵴減少、膜電位降低、ROS 水平升高、ATP 產(chǎn)生下降，最終引起神經(jīng)元死亡［56］。研究發(fā)現(xiàn)，CHCHD10 與TDP-43 發(fā)生相互作用。在TDP-43 轉(zhuǎn)基因小鼠和ALS患者的病理樣本中，CHCHD10表達(dá)量下降［41，44］。在細(xì)胞系中過表達(dá)TDP-43 后，CHCHD10進(jìn)入細(xì)胞核［57］。在HeLa 細(xì) 胞 中，將CHCHD10 敲除或者轉(zhuǎn)染CHCHD10 的突變體，TDP-43會在細(xì)胞質(zhì)中聚集，并進(jìn)入線粒體［57］。與對照組相比，TDP-43 與S59L-CHCHD10 突變體相互作用增強(qiáng)，CHCHD10 突變體導(dǎo)致TDP-43 蛋白形成不溶性的蛋白質(zhì)聚集體，使其更多地進(jìn)入線粒體，造成線粒體損傷［38］。根據(jù)曼德斯重疊系數(shù)（Mander's overlap coefficient，MOC）計算FTLD和AD 患者腦組織樣本中磷酸化的TDP-43（p-TDP-43）與CHCHD10 的共定位系數(shù)，分別是0.75 和0.84，在FTLD 與AD 之間沒有顯著差異。相反，CHCHD10 與磷酸化的TDP-43 共定位系數(shù)為0.18，表明18%的CHCHD10 與p-TDP-43 存在共定位［58］。FTLD-TDP 患者腦組織樣本經(jīng)過RIPA緩沖液裂解后，檢測可溶解和不可溶解的TDP-43、p-TDP-43 和CHCHD10 的含量，結(jié)果顯示FTLDTDP樣本中不溶性的TDP-43、 p-TDP-43 和CHCHD10 分別是非患病對照組的2.1 倍、2.4 倍和1.7 倍，皮爾森相關(guān)性系數(shù)（Pearson's correlation coefficient，PCC）分析顯示，不溶性TDP-43 與不溶性的CHCHD10具有明顯相關(guān)性（R=0.640 7）［58］。在TDP-43 轉(zhuǎn)基因小鼠背景下，野生型CHCHD10使TDP-43磷酸化水平降低并抑制TDP-43聚集，減輕TDP-43 造成的病理學(xué)特征； 而突變型CHCHD10 可促進(jìn)TDP-43 磷酸化，導(dǎo)致其聚集增加［38，58］。在ALS相關(guān)突變R15L-CHCHD10患者的脊髓解剖樣本中，CHCHD10大量聚集，但未發(fā)現(xiàn)CHCHD10 聚集體與TDP-43 有明顯共定位［59］。因此，TDP-43 錯誤定位并進(jìn)入線粒體造成線粒體損傷可能也是CHCHD10相關(guān)疾病的致病因素。

6 展 望

CHCHD10的功能研究均從疾病角度出發(fā)，分析其突變體對線粒體結(jié)構(gòu)和功能造成的影響，而對其正常生理功能以及CHCHD10蛋白本身性質(zhì)的研究甚少。目前CHCHD10的生理功能主要表現(xiàn)在兩方面。a. CHCHD10 是MICOS 復(fù)合物的組成部分，但是此觀點仍然存在爭議。首先，MICOS 復(fù)合物的具體組成部分至今仍未被完全鑒定。其次，所有結(jié)果均以蛋白質(zhì)之間的相互作用作為實驗手段，還沒有其他方法證明CHCHD10 是否屬于MICOS 復(fù)合物的組成部分。目前亟待發(fā)展新的實驗方法進(jìn)行解析，或者篩選出MICOS 復(fù)合物新的組成蛋白，進(jìn)一步證明CHCHD10是否與MICOS 復(fù)合物有關(guān)。b. 在缺氧條件下，CHCHD10進(jìn)入細(xì)胞核中，通過CXXC5 與ORE 結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制COX4I2 的基因表達(dá)。使用不同細(xì)胞系進(jìn)行實驗，得到的實驗結(jié)果也存在差異，說明選擇合適的模型對于CHCHD10的功能研究尤為重要。CHCHD10是線粒體蛋白，雖然疾病相關(guān)突變對其進(jìn)入線粒體影響不大，但是表達(dá)CHCHD10突變體的細(xì)胞，其線粒體嵴卻表現(xiàn)出非常明顯的異常。因此，研究CHCHD10蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及疾病相關(guān)突變體對其結(jié)構(gòu)和功能的影響，不僅有助于揭示CHCHD10在維持線粒體嵴結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性中的重要作用，還將為理解CHCHD10 突變在相關(guān)神經(jīng)退行性疾病中的致病機(jī)理提供重要線索。